做WB提取膜蛋白时有什么注意事项？

电转印膜的选择：有NC膜、重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔径的NC膜，30KD以上用0.45 um孔径的NC膜；

转印选择恒流，每个转印槽150 mA，10KD以下转印40min，10-30KD转印50min，30-100KD转印70min，100kd以上转印80min，转印完毕可用丽春红S染膜检测转印是否成功，转印结束后去除NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验。

要使蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的PH值很重要，有些分子量不是很大的蛋白质区带，即使延长电转印时间也不能从凝胶转移到膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态造成的，因此应适当改变转移缓冲液的PH，以利于转膜。另外，对于分子量较小的蛋白质，可在缓冲液中加入适量甲醇，因为甲醇能促进它们固定在固相膜上。但是对于大分子量的蛋白质，尤其是碱性蛋白质，缓冲液中是不宜加入甲醇的，因为甲使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白的转移，甲醇能将结合在碱性蛋白质上的SDS解离出来而使其带正电或呈电中性蛋白质就更难从凝胶中转移出来

1,提取蛋白质过程中，应在低温环境下进行，以抑制蛋白酶的水解作用（可加入适合的蛋白酶抑制剂）。

2. 蛋白样品建议分装后冷冻干燥或直接以液体态置-80℃中保存，不要反复冻融。

3.蛋白浓度低时，可使用超滤膜浓缩或者用真空冻干机将蛋白冻干。