实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问怎么构建一种能在细胞中产生环状RNA的质粒？有什么参考资料？

汤姆卜丽波

参考一下这个文章https://wap.cnki.net/touch/web/Conference/Article/ZGXJ201711001258.html

3 回答571 围观

问mRNA疫苗，质粒加A尾，怎么构建质粒？

汤姆卜丽波

就是基因工程的一部分，获取目的基因，载体。酶切，连接，转化，挑单克隆，验证。

4 回答1291 围观

问单酶切之后用T4连接酶构载，菌长了满板，pcr验证全是空载。

灵枢天问

这个体系是按摩尔比来的么，你测目的基因和载体浓度了么

6 回答1674 围观

问质粒构建中，pcDNA3.1(+)上，插入两个蛋白，选用什么启动子？各启动子会有干扰吗？

灵枢天问

CMV吧，如果是两个启动子合负责一个片段，那只要插入位点合适，没有其他干扰

4 回答565 围观

问构建点突变基因载体，突变效率低，有没有好用的酶。

bamboopiggy

好像有个专门做点突变的kit，你可以找找看，如果不行，建议做长引物pcr来做突变点。

2 回答400 围观

问膜蛋白的提取效率低，而且检测到大多数为阶段后的蛋白

汤姆卜丽波

以下是提膜蛋白的protocol, 有些注意要点，是不是没有注意到， 1.将离心管柱及接收管套管放置冰上预冷。 2.细胞样品，贴壁细胞样品建议使用细胞刮刀收集，尽量不使用胰酶消化，细胞量为 20-50 X 106 个细胞。 3a.用预冷的 PBS 清洗一次细胞。Buffer A 中重悬细胞（起始细胞数小于 5X 106 加入 200ul Buffer A，起始细胞数大于 5X 106 加入

3 回答197 围观

问求助大佬们，酵母单杂的点板结果不明显，空载和目的基因启动子共转在不同浓度抑制剂的缺陷板上都能长，是表示没有互作吗？谢谢！

汤姆卜丽波

首先确定你的培养基各个组分没有受到蛋白胨，酵母粉等的污染，重新按照上述配方配制MD。然后需要确定你的感受态是不是有问题：分别划板MD,YPD（倒平板时加点氨苄和卡那，防止E.coli的污染。）

3 回答1011 围观

问PCR产物跑完核酸胶以后泳道里有拖尾

汤姆卜丽波

有蛋白污染的可能吗？或者PCR的退火温度适当可以提高一些以减少引物和模板的非特异结合。适当减少PCR体系的模板量。

5 回答1958 围观

问请问提取植物DNA时如何有效的去除酚类和多糖物质

bamboopiggy

取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，混匀后置水浴中；离心机中离心后弃上清；加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心后弃上清；向沉淀中加入预热的3×CTAB裂解液并混匀，水浴裂解；加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入NaCl和冰异丙醇，混匀，沉淀1～3小时；取出离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即完成提取

4 回答3817 围观

问琼脂糖凝胶电泳拖尾的原因，用的是KOD酶预混mix做PCR，以前能跑出清晰条带，现将试剂都尝试换了遍，都没改善

dxy_oeu11rar

不知道marker是不是也有拖尾现象，如果marker正常，有可能是你的模板浓度太高。如果marker不正常，排查一下琼脂糖凝胶和缓冲液的问题，buffer不正确也可能产生拖尾

6 回答858 围观

问qRT-PCR结果的cq值误差多少内可以用？

whilt-shirt

新版的软件都叫Cq值，不叫Ct值了，不必理会。Ct值15－25是最好，10－30之间也接受。如果超过30了，得看一下复孔是否一致，如果一致，也接受。如果不一致，基本就是废的。

5 回答7892 围观

问DNA重组相关问题？

急诊科ys

用高效连接酶连，400U或2000U，还可延长反应时间

8 回答658 围观

问State-dependent opioid control of pain

汤姆卜丽波

可以找学校图书馆文献传递，或者联系通讯作者求文章

4 回答399 围观

问测序结果为什么看不到我克隆的酶切位点？

Junego

测序引物距离你的酶切位点有多长？如果引物到酶切位点过近或太远都测不到的。一条引物测序结果可信长度就700-800bp，要不换条引物试试。

8 回答841 围观

问小鼠成瘤肿瘤大小计算

汤姆卜丽波

参考这片文章https://www.bio-equip.com/showarticle.asp?id=453107633

4 回答13659 围观

问PCR结果怎么看？如何区分真假阳？

dxy_oeu11rar

通过琼脂糖凝胶电泳可以看到pcr结果，设置阴阳对照可以区分真假阳性，通常情况下阴性对照设置成水对照，即体系中不加入DNA模板，如果阴性对照无条带，结果更加可信

7 回答1710 围观

问已经测序正确的菌液，再提质粒时发现酶切验证切不开，酶活性没问题。酶切位点之前也是切过得。是什么原因呢

dxy_l3h8h19

是不是操作有误啊？还有，已经测序正确了为什么还要酶切验证？如果是单酶切的话切没切开可能差距不大，看不出来有没有切开。

7 回答1548 围观

问10倍溶液稀释到1倍溶液是用水还是生理盐水配啊

whilt-shirt

看你做的实验，如果最终的稀释溶液作用于细胞或者动物或者组织，那就需要用PBS或者生理盐水稀释，如果是用于非生物样本，那一般是用水

5 回答486 围观

问如何用购买的阳性质粒制作转基因含量0.01%的阳性样品？例如：已知一个35s质粒，86bp，5微克，干粉。

bamboopiggy

可以参考一下这个专利：https://patents.google.com/patent/CN1718743A/zh本发明公开了一种转基因烟草检测方法，包括(一)巢式PCR定性检测：获得可用于PCR反应的样本DNA，同时检测样本的花椰菜花叶病毒启动子调控序列CaMV 35s、根癌农杆菌终止子调控序列nos和抗卡那霉素选择标记基因序列NPT II，引物的核苷酸序列见序列表SEQ ID No.1至SE

3 回答327 围观

问无缝克隆如何设计引物？引物一般设计多长？很长的引物需要找公司定制吗？

此用户已注销

根据同源臂设计引物，一般15-20bp。很长的引物需要找公司定制。

7 回答3661 围观

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