• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购

        pcr扩增时Taq酶的选择有哪些要点?

        user-title

        果冻小宁

        wx-share
        分享

        4 个回答

        user-title

        Wcrystay

        有帮助

        特异性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度等等

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        根据你的实验目的,选择特异性强,灵敏度高,简便,快速的,对样品的纯度要求低一些。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        高特异性Taq酶

        高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求,影响PCR特异性的因素很多,包括模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等,而高特异性Taq 酶的出现大大减少了摸条件这一繁琐的实验过程,也为PCR产物快速有效的纯化(PCR产物直接纯化)打下了基础。这类酶最典型的代表是热启动Taq酶。大家都知道,在PCR第一个循环变性之前,有一个升温的过程,引物和模板会有一些非特异性配对,如果这时Taq酶发挥活性,就很容易产生非特异性扩增,由于循环初期模板量非常少,产生的非特异性条带经过后面的指数扩增,就会严重干扰目的片段的扩增,甚至导致特异性条带不能扩出。

        而热启动Taq酶是必需经过高温才能激活的酶,因此在初始循环的变性之前它没有活性,不会产生非特异性扩增,这就大大提高了PCR扩增的特异性。第一代热启动Taq酶往往直接在Taq 酶上做一些修饰,比如用抗体抑制,蜡封等,如Clontech、Stratagen、Gibcol-LTI的一些产品,由于抗体、蜡等异物的掺入,对实验造成一定的影响,也给试验者带来一些不便。新一代的热启动Taq酶是通过内部改造的重组酶,真正实现便利的热启动,代表产品如QIAGEN公司的 HotStar系列,无需别的辅助抑制物,也不用担心抑制不稳定,使用起来方便、高效。此外,由于几乎所有的Taq酶产品都带有相应的反应缓冲液,缓冲液的品质也对保证Taq酶特异性扩增起着不可忽视的作用,一般的缓冲液中调节H键作用的盐只有KCl,QIAGEN公司的缓冲体系通过 KCl、(NH4)SO4盐离子体系的平衡调节也提高了酶作用的特异性。

        此外,热启动的Taq酶也是实现一步法RT-PCR的基础。如QIAGEN公司的OneStep RT-PCR试剂盒,在RT反应较低温度下,Taq酶没有活性,逆转录酶发挥活性;RT反应结束,高温灭活逆转录酶的同时,激活Taq酶,进行PCR反应。另一家公司Epicentre有一种MasterAmpTM Tth DNA聚合酶,本身就具有逆转录酶活性,也可用作RT-PCR。

        高保真Taq酶

        下游应用为基因筛选、测序、突变检测,分子诊断等等的用户,往往对PCR保真性要求很高,保真性的一个通用标准是错配率,错配率越低保真性越好。普通Taq酶的错配率在2-5X10-5碱基/循环数,而高保真Taq酶错配率可达10-6数量级,大大降低了出错的可

        user-title

        未来9

        有帮助

        选择要点指标主要包括:特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优化条件难易等等

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序