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        以片段为模板pcr扩增,杂带很多原因

        相关实验:重叠延伸 PCR

        user-title

        棋NKKP

        以重叠延伸得到的2k片段为模板扩增,多管跑胶回收,有的得不到产物,有的杂带很多,引物等问题都已经核对过,请帮忙分析原因

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        5 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        是否可以把你的2k的片段做TA克隆,整到载体上,然后再以质粒为模板进行pcr,或者把你重叠延伸得到的2k片段,纯化后再pcr。

        user-title

        汤姆卜丽波

        有帮助

        是不是这个片段本身不纯,建议将片段跑胶回收纯化后在扩增

        user-title

        一枝七叶

        有帮助

        退火温度不合适或者体系成分浓度不合适可能会导致条带弥散。不过我有看到资料说pcr循环次数过多和模板含有酒精也有可能导致这样

        user-title

        未来9

        有帮助

        扩增产物出现多条带(杂带)的原因很多,除外引物原因还有:

        1) 循环的次数过多。

        适当增加模板的量,减少循环次数。

        2) 酶的用量偏高或酶的质量不好。

        应降低酶量或调换另一来源的酶。

        3) 退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。

        应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。以2度为梯度设计梯度PCR反应优化退火温度。

        4) 样品处理不当。

        5) Mg2+浓度偏高。

        因适当调整Mg2+使用浓度。

        6) 若为PCR试剂盒。

        也可能时试剂盒本身质量有问题。

        7) 复制提前终止。

        使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。

        8) 反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。

        确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。

        9) 模板量过多。

        质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

        10) 外源DNA污染。

        确保操作的洁净。

        user-title

        天一湖医者

        有帮助

        1.引物用量偏大,引物的特异性不高。 应调换引物或降低引物的使用量。

        2.循环的次数过多。 适当增加模板的量,减少循环次数。

        3.酶的用量偏高或酶的质量不好。 应降低酶量或调换另一来源的酶。

        4.退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。 应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的PCR扩增。

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