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        PCR中关于cDNA的一点疑问

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

        user-title

        未来9

        最近在做PCR,几乎每天都用同一管中的cDNA做模板,cDNA是放在-20°C的,用完再放回去,但是跑出的条带越浅,直到没有条带了,大概不到半个月的时间。有的时候连续两天跑的条带清晰度都差得很明显。请问是cDNA的问题吗?

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        6 个回答

        user-title

        小K学弟

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        反复冻融导致模板降解了,经常要用分一点放四度留着用,剩下的按要求放负二十。一般蛋白酶、引物、核酸都是不能反复冻融的。

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        是cDNA降解了,天天反复冻融,再结实的东西都不行,你以后还是分装用吧,冻融个3-4,就别再用了

        user-title

        汤姆卜丽波

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        DNA反复冻融的问题吧,反复冻融会破坏DNA双链结构,后面自然就会p不出来

        user-title

        balalaLy

        有帮助

        cDNA一般很少出问题,除非反复冻融次数太多,

        条带越来越淡有没有可能是你的酶出现问题了?酶反复使用过程中没有注意低温操作也容易成问题

        user-title

        丁香清香

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        会不会是你反复冻融的问题。

        核酸最忌讳反复冻融,反复冻融会发生降解的,要么分装冻存,要么一直放4℃,在4℃可以放置半年没有问题,甚至更长时间

        user-title

        Eason老歌迷

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        cDNA之制备后最好赶快用掉,在-20冰箱存放一般不要超过一个月,引物反复冻融或存放时间太长也会出现问题,建议你用此模板,使用其他的引物如18sRNA看看能否扩出条带,如果不行,那就是模板不行,如果可以那就换引物,当然还有可能是你的酶出问题了,换个酶试试,想知道结果就一步步排查,做几个重复,把酶,缓冲液,模板,引物,PCR水都换一遍,每个重复只换其中一个,然后在同样的反应程序,同样反应体系进行扩增,就可以找出问题之所在

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