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科研学霸天团，48小时有问必答

问荧光定量PCR内参没有结果的原因？

dxywode

先做普通PCR，电泳检测，看看目的条带好不好，好的话，再做qPCR，普通PCR做好了，qPCR的结果自然好。

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问PCR条带时好时坏是引物坏了吗

迟C迟

请问是什么问题？扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系与反应起始时RNA的总量及纯度有关建议在试验中加入对照RNundefined一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/1undefined建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP

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问nk细胞偏低要不要紧？

天一湖医者

NK细胞偏低可能由血液系统肿瘤如白血病、实体瘤如淋巴管瘤、免疫缺陷病如系统性红斑狼疮、艾滋病等疾病引起，临床常采用一般治疗、药物治疗、手术治疗等方式。

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问PCR 扩增的体系条件应该怎么摸？一般要先从哪项开始？为什么进行复合扩增体系条件就要重新摸？

bamboopiggy

如果你不想摸条件的话，可以在你正式pcr cycle前加一个touch down的程序，这样基本都可以跑出条带来。

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问临床组织标本冻存已久（半年以上），还能做PCR吗？

天一湖医者

基本上不可能成功了。mRNA都降解完了。要做RT-PCR应该尽量选择新鲜的组织材料，即使保存，也要-80°，而且时间不要太长，最多几天吧。

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问实时荧光定量PCR进行HRM曲线进行分析HRM的温度条件应该如何诱导异源双链的发生？

未来9

利用PCR缓慢变性： 95℃变性5分钟,然后以 0.03℃/S速率缓慢复性至25℃,使杂合子形成异源双链

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问在做实时荧光定量PCR中的基因分型，在扩增体系中加入石蜡油和甘油有什么样的好处？

天一湖医者

石蜡油，甘油具有良好的渗透能力，可以进入细胞内部和胞内大分子形成氢键以取代干燥脱除的水分，从而维持蛋白质、碳水化合物及脂肪等大分子活性物质的原有结构。此外，还可以起到降低细胞脱水皱缩和缓解复水肿胀的效果。另外醇和糖类相似均具有醇和糖类羟基官能团，均能产生“优先水化作用”以及改变体系的玻璃态转变温度等，故在发挥保护效果方面和糖类具有一定共性。须知蛋白在使用时候存在冻融情况下建议可以选甘露醇、右旋糖酐

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问实时荧光定量PCR，扩增后进行链熔解曲线基线高且杂峰较多怎么回事？

bamboopiggy

melt curve杂峰多，说明你的primer不特异,有非特异产物的产生

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问细胞培养需要注意哪些细节？

异乡人hyq

在细胞培养过程中，除了细胞本身的生长特性，环境也会影响细胞的状态。1：细胞生长的附着物或支持物性质（如：细胞培养瓶/板或细胞培养载体）；2：细胞培养基的理化性质和成分；3：气相成分；4：培养温度等。合适的培养环境才可以使细胞表现出特定的功能。

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问细菌QPCR相关问题请教

Topmicro

你提取的RNA肯定是有问题的，不单纯是纯度的问题，你最好使用试剂盒来提取，简单还能保证提取质量，可以用天根的试剂盒。

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问怎样实现单细胞测序数据最大化

迟C迟

单细胞数据分析的第一步就是分亚群（当然前期肯定是需要先做数据预处理的），通过样本比较发现新的细胞亚群或比例差异显著的亚群。亚群分好之后最重要的一步（也是最难的一步）就是对亚群进行细胞类型注释了。我们会结合细胞类型marker基因、细胞类型注释软件和文献数据做比对的方法综合进行注释。第二步：寻找marker标志，根据自己实验数据的分类亚群，找每一个亚群特异表达的marker基因。如果某个亚群只在疾病

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问PCR的阶段的作用为什么分这么多阶段 cDNA浓度的范围DNA/RNA比值。

Topmicro

变性、退火、延伸需要不同的温度条件和反应时间所以分阶段进行。

3 回答772 围观

问荧光定量PCR冰上操作

未来9

是的，RNA很容易降解，尤其在水溶液中，提取时尽量在低温进行如果操作时间长，降解太多，肯定会影响实验结果

3 回答432 围观

问重叠pcr没有条带，试过不同模板浓度，不同tm值，不同保真酶，怎样才能重叠成功？

微暖

引物设计:第一条片段的反向引物包含第二条片段的25bp左右，第二条片段的正向引物包含第一条片段的25bp，引物长度大概50多bp。分别扩增两条片段。以这两条片段为模板，第一条片段的正向引物和第二条片段的反向引物，pcr扩增就好了。

3 回答727 围观

问为什么在FAM VIC ROX CY5四个通道下，在做试剂加速的时候，FAM通道总是扩增变差？

n0y0j7

四个通道波长不一样，还是fam用的多，性能变差

2 回答411 围观

问引物设计及内参问题（救救）

cxsm

这个检测的是人的前列腺癌的基因变化，应该用人的。

3 回答582 围观

问各位朋友，请问病毒反转录体系中加入RNA样本的量要怎么确定呢？

bamboopiggy

说明你的rna测得浓度有问题，你先看那你的rna的260/230，260/280 是不是在1.8-2.0之间，如果低于这个数值，说明你测得rna得浓度，比实际浓度要高，你需要改善你提的rna的质量。

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问PCR引物设计及内参

天一湖医者

引物设计用动物基因好就可以内参也可以用动物源设计

3 回答1304 围观

问在NCBI上检索RORγt的RNA编码，发现有isoformX1、2、3和4这四种型别？请问该怎么选？

bamboopiggy

选四个isoform都包含的片段来检测rna，除非你的组织中有多种isoform，你又要区分

2 回答783 围观

问cDNA在-20℃可以保存多久？

dxy_0vzvh5k

-20℃保存半年没问题，不要反复冻融。

4 回答3825 围观

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