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关于随机引物反转录的一些问题
Eason老歌迷
你想纯化,但是发现没有过滤掉短的,是这样吗?我有一个方法,可以试一试。1. 20μLPCR产物加入5 μL 5M的NaCl(终浓度0.5 M)。2. 加入25 μL 24%的PEG8000溶液(终浓度12%);混匀。3. 4度放置30 min。4. 4500 g,4℃离心30 min 后,立即将板反扣在厚的吸水纸上,离心至150 g,去除上清。5. 加入70 μL 75%EtOH,4500 g,4
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问
酿酒酵母基因敲除菌液pcr没有条带
急诊科ys
1排除细菌污染可能2提取过程是否存在问题,必要时可重新提取进行实验
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问
有关PCR的问题,大神求助呀:
Miracle星
七条带,只跑出一条带原因可能:a DNA marker 上样量不够按照说明书加样,或者根据自己的实验样品调整加样。b DNA电泳跑出凝胶电泳时,将溴酚蓝跑到胶长的2/3处即可停止电泳。更小的DNA片段可能需要电泳的时间更短。比如1/2c DNA条带被示踪染料所遮盖选用不同的电泳loading dye,使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰,或者适当降低loading dye用量。d 凝胶中未加核酸
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荧光定量pcr遇到的问题,求助
Bumihiko
一般来说影响不大的,既然说明书写30s已经足够的话,就没必要用60s那么长时间,不过用了60s结果应该也会差不多
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问
PCR跑胶条带还可以,切胶回收浓度是负的.
balalaLy
回收试剂盒试剂有没有弄混,溶胶的过程胶有没有完全溶解,回收最后一步建议用50度左右的buffer溶解产物,可以加大产物得率
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问
求大神给分析一下pcr失败的原因
dxy_g9y5gije
考虑三个方面第一是DNA,内参基因验证第二是TM值,设置温度梯度第三是引物,多试几条引物挨着验证
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问
载体构建时遇到了问题
汤姆卜丽波
这应该是酶切位点不太对,没有在产物头尾,在产物中间
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问
如何判断pcr样本是否污染,怎么避免?
dxy_g9y5gije
pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系,那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话,考虑重新获取模板比对
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问
构敲降质粒,测序结果比对,两个酶切位点和载体序列都对上了,只有合成的敲降序列后半段不对 。是单链退火有问题还是公司合成的序列不对
天一湖医者
序列的方向需要验证,因为TA是随机插入到载体里面的。所以先用一个载体引物和你的insert引物配对检测得到正确方向插入的clones。
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问
做了三次qpcr独立重复,前两次都有相同趋势,第三次出现了严重反差,实验过程是没问题的操作也很严谨,这种情况要怎么办呢
dxy_g9y5gije
遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试,因为导致这种结果出现的情况太多了,需要逐一排除
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问
当PCR产物有两条带的时候,怎么才能快速提高特异性?
Miracle星
出现多条条带表示PCR反应的特异性不高,可以进行如下优化尝试:1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高,DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构,如果引物Tm值过高,上下游引物Tm值相差太大,或者引物单链易形成高级结构,都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯,条带越特异。反之模板杂乱(例如cDNA文库
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问
引物是经过PAGE纯化的,为什么还有碱基缺失或插入?
dxy_j7jezao0
与它的纯化回收方式有关,更换其它高纯度纯化方式
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问
我是要扩增一个片段,加上双酶切位点,片段就那么大,我就需要那么大加酶切位点?这引物怎么设计?是不是只要5‘端序列,以及3’端的反
dxy_j7jezao0
5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段,网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计,符合一些引物设计原则就好
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问
我设计的引物为:上游引物:TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物:ATAAGAAT GCGGCC
bamboopiggy
你能不能换个酶?你选的这两个酶,全是GC的,本身就会导致TM值升高,再加上上游起始序列中GC含量也比较高,所以你换个酶比较合适。
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问
普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别
dxy_j7jezao0
qPCR为保证扩增效率,产物片段较小,70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小
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问
实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT
dxy_j7jezao0
下游引物可以,这就是RT中所说的特异引物
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问
荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因?怎么解决?
bamboopiggy
一般情况是引物不特异,可能有多个产物。不能用,换个引物。
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问
PCR实验中菌落PCR检测有条带,接种大摇后无条带
bamboopiggy
一般菌落pcr,可能会存在插入片段也转入菌种,但是没有和载体连接成功。所以一般做完菌落pcr以后,先要送测序,测序成功,才大摇比较合适。
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问
PCR实验中扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散
bamboopiggy
可能产物不特异,出现多条带,但是片状弥散,可以考虑灌胶不匀,尤其是在胶中直接加入EB或GV的情况下
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问
请问 PCR引物长度24点情况下,错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率?
dxy_j7jezao0
不确定,引物特异性主要受3'端序列影响,错配在5'端,影响较小。
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