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科研学霸天团，48小时有问必答

问有关PCR的问题，大神求助呀：

Miracle星

七条带，只跑出一条带原因可能：a DNA marker 上样量不够按照说明书加样，或者根据自己的实验样品调整加样。b DNA电泳跑出凝胶电泳时，将溴酚蓝跑到胶长的2/3处即可停止电泳。更小的DNA片段可能需要电泳的时间更短。比如1/2c DNA条带被示踪染料所遮盖选用不同的电泳loading dye，使待检测的DNA样品避开示踪染料的干扰，或者适当降低loading dye用量。d 凝胶中未加核酸

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问荧光定量pcr遇到的问题，求助

Bumihiko

一般来说影响不大的，既然说明书写30s已经足够的话，就没必要用60s那么长时间，不过用了60s结果应该也会差不多

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问PCR跑胶条带还可以，切胶回收浓度是负的.

balalaLy

回收试剂盒试剂有没有弄混，溶胶的过程胶有没有完全溶解，回收最后一步建议用50度左右的buffer溶解产物，可以加大产物得率

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问求大神给分析一下pcr失败的原因

dxy_g9y5gije

考虑三个方面第一是DNA，内参基因验证第二是TM值，设置温度梯度第三是引物，多试几条引物挨着验证

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问载体构建时遇到了问题

汤姆卜丽波

这应该是酶切位点不太对，没有在产物头尾，在产物中间

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问如何判断pcr样本是否污染，怎么避免？

dxy_g9y5gije

pcr样本污染是指模板污染还是整个体系污染呢如果是体系，那么做好阴性克隆和阳性克隆就可以判断如果是模板的话，考虑重新获取模板比对

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问构敲降质粒，测序结果比对，两个酶切位点和载体序列都对上了，只有合成的敲降序列后半段不对。是单链退火有问题还是公司合成的序列不对

天一湖医者

序列的方向需要验证，因为TA是随机插入到载体里面的。所以先用一个载体引物和你的insert引物配对检测得到正确方向插入的clones。

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问做了三次qpcr独立重复，前两次都有相同趋势，第三次出现了严重反差，实验过程是没问题的操作也很严谨，这种情况要怎么办呢

dxy_g9y5gije

遇到这种情况建议详细记录实验过程再次尝试，因为导致这种结果出现的情况太多了，需要逐一排除

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问当PCR产物有两条带的时候，怎么才能快速提高特异性？

Miracle星

出现多条条带表示PCR反应的特异性不高，可以进行如下优化尝试：1.适当提高PCR的退火温度。退火温度越高，DNA分子之间的配对越困难。这样可以减少引物与模板之间非特异性的结合。2.检查一下引物的Tm值和序列结构，如果引物Tm值过高，上下游引物Tm值相差太大，或者引物单链易形成高级结构，都不利于PCR反应。必要时重新设计引物。3.检查一下模板纯否。模板越纯，条带越特异。反之模板杂乱（例如cDNA文库

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问引物是经过PAGE纯化的，为什么还有碱基缺失或插入？

dxy_j7jezao0

与它的纯化回收方式有关，更换其它高纯度纯化方式

4 回答433 围观

问我是要扩增一个片段，加上双酶切位点，片段就那么大，我就需要那么大加酶切位点？这引物怎么设计？是不是只要5‘端序列，以及3’端的反

dxy_j7jezao0

5'端加上酶切位点不影响你扩增目的片段，网上用软件设计可以直观作出对引物的评价。你也可以自己设计，符合一些引物设计原则就好

4 回答866 围观

问我设计的引物为：上游引物：TCC CCCGGG ATGGCTCCACTTCACGAATC下游引物：ATAAGAAT GCGGCC

bamboopiggy

你能不能换个酶？你选的这两个酶，全是GC的，本身就会导致TM值升高，再加上上游起始序列中GC含量也比较高，所以你换个酶比较合适。

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问普通pcr引物设计和荧光定量pcr引物设计的区别

dxy_j7jezao0

qPCR为保证扩增效率，产物片段较小，70-250bp,TM值一般60左右其他差别较小

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问实时荧光定量PCR 的引物能不能用来做RT

dxy_j7jezao0

下游引物可以，这就是RT中所说的特异引物

5 回答314 围观

问荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因？怎么解决？

bamboopiggy

一般情况是引物不特异，可能有多个产物。不能用，换个引物。

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问PCR实验中菌落PCR检测有条带，接种大摇后无条带

bamboopiggy

一般菌落pcr，可能会存在插入片段也转入菌种，但是没有和载体连接成功。所以一般做完菌落pcr以后，先要送测序，测序成功，才大摇比较合适。

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问PCR实验中扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

bamboopiggy

可能产物不特异，出现多条带，但是片状弥散，可以考虑灌胶不匀，尤其是在胶中直接加入EB或GV的情况下

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问请问 PCR引物长度24点情况下，错配几个碱基仍能P出来、基本不影响效率？

dxy_j7jezao0

不确定，引物特异性主要受3'端序列影响，错配在5'端，影响较小。

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问如何针对致泻性大肠ETEC的stp和sth基因设计特异性强且有效的引物和Taqman探针？能够使Ct值小一点，荧光强度值大一点

Miracle星

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。2、引物GC含量一般为40%-60%， 45-55%为宜，GC含量过高或过低都不利于引发反应，上下游引物GC含量和Tm值要保持接近，一般Tm值不超过5℃。3、引物所对应的模板序列的Tm值在55-80℃之间，最好为72℃左右。4、引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修

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问跑qPCR，内参基因和目的基因CT值正常，结果也比较理想，但内参基因熔解曲线呈较宽的单峰，Tm比目的基因熔解曲线低很多，有效吗？

bamboopiggy

看图，感觉两个melt curve 底边是一样宽的，但是你如果觉得内参基因的宽，可以考虑换一个大家常用的内参基因试试，一般情况，内参基因不会出现这种问题。

3 回答832 围观

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