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        关于随机引物反转录的一些问题

        相关实验:重叠延伸 PCR

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        嘻哈哈哈321

        各位大佬,我在mRNA反转录合成cDNA后,想要通过随机引物的形式合成第二链。...之后我PCR成双链之后用磁珠纯化,发现并没有过滤掉短片段,但造成了浓度的降低。想问一下这是什么情况造成的。

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        3 个回答

        user-title

        Eason老歌迷

        有帮助

        你想纯化,但是发现没有过滤掉短的,是这样吗?我有一个方法,可以试一试。1. 20μLPCR产物加入5 μL 5M的NaCl(终浓度0.5 M)。2. 加入25 μL 24%的PEG8000溶液(终浓度12%);混匀。3. 4度放置30 min。4. 4500 g,4℃离心30 min 后,立即将板反扣在厚的吸水纸上,离心至150 g,去除上清。5. 加入70 μL 75%EtOH,4500 g,4℃离心15 min,立即再板反扣在厚的吸水纸上,离心至150 g,去除上清;重复一次。6. 50℃或室温干燥,加入10 μL ddH2O溶解,即为纯化的PCR产物,测序时取1 μL 做模板。

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        你是想用cDNA扩增你想要的目的片段吧?可能你的片段太长了,或着你需要用特定引物来进行pcr扩增。

        user-title

        whilt-shirt

        有帮助

        有可能是引物不匹配,建议设计新的引物

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