荧光定量PCR熔解曲线出现多峰是什么原因？怎么解决？

一般情况是引物不特异，可能有多个产物。不能用，换个引物。

1.扩增效率过高 出现非特异扩增或引物二聚体:反应体系内模板浓度太高以及模板核酸质量较差,可能导致出现抑制 PCR 反应的现象。在绝对定量时表现扩增效率大于110%。 解决方案:去除模板浓度最高的反应孔并重新分析标准曲线;对目的基因做标准曲线,一般用质粒做梯度稀释,或用 PCR 产物做梯度稀释,然后做定量扩增,通过曲线评估反应效率。绝对定量有效的扩增效率在 90%-110%;重新纯化模板,去除模板中存在的潜在抑制物。

2.扩增效率过低 扩增效率过低主要表现在试剂浓度不适(主要是引物、镁和 Taq DNA 聚合酶,尤其是在多重实验中),引物对Tm之间的差异超过5°C以及热循环条件不适,试管中各种同源物质的竞争作用可造成反应效率低下。

要是出现多峰，可能有几种原因，可能存在引物二聚体,建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。或者是引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。要不然是gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。