实验问答21,902,842 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

问同源重组第一次交换后菌落pcr没有带为什么

loveliufudan

同源重组的第一次交换需要确保有足够的质粒模板和恰当的条件。如果PCR没有出现目标带，可能是以下原因之一：质粒模板的浓度不足。如果使用的质粒量太少，PCR扩增可能不足以产生足够的目标带。建议使用更高浓度的质粒模板，并在PCR反应中增加扩增周期数和/或使用更高灵敏度的PCR酶。PCR反应条件不恰当。PCR反应温度和时间以及PCR缓冲液成分可能影响PCR扩增结果。建议调整PCR反应条件，尝试更多的PCR

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问荧光定量pcr数据

loveliufudan

RQ（relative quantification）是相对定量分析中的一个指标，表示目标基因表达量与参考基因表达量的比值。RQmin和RQmax是RQ的最小值和最大值，通常用于评估相对定量结果的可靠性。关于RQmin和RQmax的计算方法，通常会根据实验的具体设计和分析策略而有所不同。但一般情况下，它们是根据样品的Ct值以及参考基因的表达稳定性指标（如ACtSD）计算得出的。下面是一种计算RQm

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问荧光定量NTC有峰值

sswei

反应体系组分（如，水）被污染：实验过程中，更换新的Mix或者水重复实验;标本间的交叉污染或产物污染：反应体系在超净工作台内配制，对实验室进行严格的区分，减少气溶胶污染；使用带滤芯的枪头。

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问引物设计

loveliufudan

设计pre-miRNA和pri-miRNA的引物需要注意以下几点：确定目标序列：首先需要确定目标miRNA的pre-miRNA或pri-miRNA的序列，可以通过基因组浏览器等工具获取。引物长度：通常选择长度为18-24bp的引物。Tm值：引物的Tm值需要在50-65摄氏度之间。特异性：引物需要具有较好的特异性，避免引物与非目标序列的杂交。引物设计软件：可以使用一些在线或离线的引物设计软件，例如P

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问求问 qpcr这种曲线到底是什么问题呢

土井挞克树

纵坐标设置太紧凑，区别无法直观观察

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问二次pcr

loveliufudan

可能有多种原因导致PCR产物暗或者模糊。以下是一些可能的原因和解决方法：反应条件不正确。确保PCR反应体系中的所有试剂品质良好，反应条件正确。如果反应体系中某些试剂的质量差，可以尝试使用新的试剂来重新制备反应体系，如果条件不正确，则可以调整反应温度、时间和引物浓度等参数。降解的DNA模板。如果模板的质量不好，例如DNA受到过度酶解、酸碱条件不佳等等，可能会导致PCR产物的低浓度或者失真。可以尝试使

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问请问磷酸化不是发生在蛋白修饰阶段吗为什么在文章里看到了磷酸化的引物来进行处在mRNA水平的PCR实验

dxy_mqg1dtg8

我感觉是这篇文章出现的一个错误：1：压根没有pSTAT3这个基因，是怎么设计的引物，我们在文章中常见的检测pSTAT3方法大都是WB，没见过qPCR；2：磷酸化是翻译后的修饰，只发生在蛋白水平，转录水平怎么会出现磷酸化。

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问cDNA的保持时间和温度？

huarenqiang5

由RNA逆转录而得到的cDNA在-20°℃一般可以保存2个月左右。

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问单细胞测序多样本两组比较分析

loveliufudan

针对单细胞测序多样本的两组比较，您可以尝试使用以下工具和流程：差异基因分析工具：常用的差异基因分析工具包括DESeq2，edgeR，limma-voom等，您可以根据您的数据特点选择适合的工具。这些工具可以识别出在两个不同组别中表达显著差异的基因，从而帮助您了解它们的生物学意义和相关的通路信息。数据预处理：在进行差异基因分析之前，您需要对数据进行预处理，例如，质量控制，过滤低质量细胞和基因，归一化

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问HBMEC进行OGD/R

loveliufudan

HBMEC细胞OGD/R模型是一种常用的研究缺氧/再氧化(OGD/R)引起的细胞损伤和修复的方法。针对您的问题，缺氧和复氧的时间因实验设计和目的而异，常见的有以下几种方案：缺氧时间：一般为2-6小时，具体时间需要根据您的实验设计和研究问题确定。例如，如果您想研究缺氧对细胞代谢途径的影响，可以选择较短的缺氧时间。如果您想研究缺氧对细胞凋亡和坏死的影响，可以选择较长的缺氧时间。复氧时间：一般为2-24

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问同一条基因，一样的引物、模板、酶，在同一台pcr仪跑，但是结果如图，之前跑的比较好，今天跑的就很差强人意。

weiran0928

第二天跑的胶图下方引物二聚体明显增多，可能是引物出现了污染或降解，建议更换新的引物，可以用送的引物干粉，加入一定量dd H2O重悬即可，引物管上有说明的。

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问实时荧光定量PCR为什么模板浓度高了反而CT值增大了？

土井挞克树

可能是扩增效率低的原因，提高扩增效率

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问做qPCR时阴性对照水中一直有扩增子是怎么回事

loveliufudan

有几种可能的原因：污染：可能存在污染，即DNA或RNA在实验室环境中存在，进入了试剂或反应体系中。这种情况可能是由于实验室的DNA或RNA污染引起的，或者可能是由于PCR试剂或其他反应组分中存在的污染引起的。在这种情况下，应该检查实验室中所有试剂和反应组分，以查找可能的污染源。假阳性：假阳性是指在PCR反应中出现了扩增信号，但实际上并不存在目标分子。这种情况可能是由于反应物的特异性问题引起的。在这

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问关于荧光定量PCR的Ct值的

huarenqiang5

主要考虑以下几点原因：(1)反应的循环数不够：一般要在35个循环以上，但是过多的循环次数可增加背景值。(2)检测荧光信号的步骤有误：SYB-Rgreen法（SG法）采用的是72延伸时采集荧光信号，Taman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。(3)引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性，若是电泳条带呈弥散状，可考虑重新合成引物或探针。(4)模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释

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问请问同一个逆转录试剂盒能够既做小鼠RNA的逆转录又做人类RNA的吗？

loveliufudan

一般情况下，同一个逆转录试剂盒可以用于逆转录不同来源的RNA，包括小鼠RNA和人类RNA。这是因为逆转录试剂盒中的逆转录酶通常是通用的，能够逆转录各种来源的RNA。然而，对于某些特殊的RNA，如长RNA、短RNA、mRNA等，可能需要特定的逆转录试剂盒才能更好地逆转录。此外，逆转录试剂盒的反应体系中也包含了其他辅助试剂，如缓冲液、酶切剂、核酸酶抑制剂等，这些试剂可能会对反应的特异性、效率和准确性产

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问序列正中间有个polyA尾会影响PCR扩增嘛

土井挞克树

可以分段扩增，把polyA的位置固定在尾侧

3 回答1346 围观

问pcr，加大模板后，条带亮度没有变化(不怎么亮)，这时候要从哪里入手呢?已经跑过温度梯度了，选择了最亮的那个温度。

土井挞克树

从抗体入手，没有亮度考虑是抗体的特异度不够

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问荧光PCR上板一定得设置复孔吗？

土井挞克树

一定要设置复孔，一般是3个，且需要做三批以上

5 回答1676 围观

问用基因组DNA作为模板，对目的片段进行PCr扩增，pcr结果跑胶图如图。这是什么原因呢？要怎么解决

土井挞克树

引物设计有问题，而且pcr过程中存在降解

3 回答482 围观

问请教一下qPCR报错的问题

loveliufudan

该PCR结果中包含了多种错误提示，每个提示都可能有不同的原因和解决方法。以下是一些常见的问题及其解决方法：PRFDROP - Passive reference signal changes near CT：被标记为PRFDROP的孔的被动参考信号在CT附近发生了显著的变化，可能是由于样品或仪器问题导致的。解决方法是检查仪器和实验操作是否正确，并确保样品中的RNA/DNA质量和浓度正常。NOAMP

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