pcr，加大模板后，条带亮度没有变化(不怎么亮)，这时候要从哪里入手呢?已经跑过温度梯度了，选择了最亮的那个温度。

从抗体入手，没有亮度考虑是抗体的特异度不够

引物、模板没问题的话,就加cycle,多扩几轮,就亮了.（一般pcr酶和buffer是没有问题的,除非你反复冻融或者长时间放置室温）如果上一轮扩出来特异性好的话,可以适当降低退火温度.

多扩了几轮,退火温度也降低了,但是条带仍然很淡,这时候,基本上就是引物和模板的问题了.你要好好看看引物特异性好不好,dimer亮不亮,（自身发夹一般不会有太大影响）；模板的话,要看看GC含量高不高,模板质量好不好.引物不好只能重新设计.模板不好可以加点DMSO（GC含量高）,或者重新提取。

如果在PCR反应中加大了模板浓度，但条带亮度没有明显变化，可能有以下几个原因：

模板质量不好：PCR反应的成功与否很大程度上取决于模板DNA的质量和纯度。如果模板DNA质量不好，如存在RNA、酶、蛋白质等杂质，或者含量不足，可能会影响PCR反应的效果。因此，建议重新提取高质量的模板DNA。

反应体系的问题：如果反应体系不合适，如酶浓度过低、dNTPs浓度不足、缺失或过多的引物等，都会影响PCR反应的效果。因此，可以尝试调整反应体系的成分和浓度，优化PCR反应的条件。

扩增条件不恰当：扩增条件也是影响PCR反应效果的重要因素之一。您已经尝试了温度梯度，选择了最亮的那个温度，但是如果扩增温度、时间、循环次数等参数不合适，也可能会影响PCR反应的效果。建议优化扩增条件，尝试不同的扩增方案，如改变温度、时间或循环次数等参数。

DNA浓度过高或过低：在PCR反应中，模板DNA的浓度也是影响扩增效果的一个关键因素。如果模板DNA的浓度过高或过低，都可能影响PCR反应的效果。因此，建议尝试调整模板DNA的浓度，通常建议在100-500 ng的范围内进行PCR反应。

总之，针对PCR反应中条带亮度没有明显变化的情况，建议从模板质量、反应体系、扩增条件和DNA浓度等方面进行优化和调整，找出影响PCR反应效果的原因，以提高PCR反应的效果。