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科研学霸天团，48小时有问必答

问挑阳性克隆进行扩繁提质粒跑电泳。请教为什么质粒的条带与质粒大小条带不一致。用的10000的marker，但质粒大小为7500bp

loveliufudan

如果你用的是10000的marker，但质粒大小为7500bp，可能是marker大小和实际质粒大小不匹配导致的。建议选择大小适当的marker，并根据实际质粒大小进行优化和调整，以确保结果的准确性。

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问cDNA跑PCR跑不出条带怎么办呀

橙汁儿青柠味

首先确定引物是否正确，其次调整pcr条件，如增加模板量，降低退火温度等等

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问想要通过荧光定量pcr来检测粪便，组织中的细菌的量，可以用DNA做吗？需要内参吗？如果不需要为什么不需要？怎么做数据处理

loveliufudan

可以使用荧光定量PCR来检测粪便、组织中的细菌量，而DNA是进行PCR的重要基础。通常情况下，荧光定量PCR需要使用内参来校正PCR反应的变化，以确保可靠的定量。内参通常是一个稳定的基因，在样本中的表达量相对稳定，且与待检测的靶基因有相似的扩增效率。使用内参可以帮助纠正PCR反应的波动，使得PCR反应更加准确可靠。然而，在一些特殊情况下，如粪便等样本中可能存在许多抑制性物质，这些物质可能会干扰PC

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问各位大佬帮帮忙🥺 第一张是DNA的电泳图第二张是PCR后的为什么条带那么拖而且第二张最后一个是水为什么也Ｐ出来了呀？

橙汁儿青柠味

条带拖尾表明不纯存在杂志，水也能pcr出来，表明系统中存在污染，但如果分子量很小可能是引物二聚体

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问做qPCR，ct值为35，有参考意义吗？

dangaozhanghui

通常情况下是没有意义的，这种基本判定为不表达。但也要具体情况具体分析，因为有些特殊的检测，需要对照试剂盒给出的参考范围，进行判断(●°u°●)」

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问PCR结果和生信结果相反

土井挞克树

可能是生信验证几乎覆盖基因的外显子区域，因此获得的基因表达量实际上综合考虑了该基因所有外显子区域的表达水平。而qCPR的定量是在局部区域设计引物并扩增，并不会考虑到基因全长。就会导致两种检测结果不一致的情况，这时建议把基因的外显子去掉，就可以避免得到相反结果

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问2个ntc有扩增曲线和熔解曲线，另外一个没有，正常吗，原因是什么，解决方法是什么

loveliufudan

如果您的样品中的两个NTC都显示了扩增曲线和熔解曲线，而另一个NTC没有，那么可能有以下原因：该NTC的PCR反应可能失败了，没有扩增出任何产物，导致没有曲线。这可能是由于技术问题，如引物或探针的失效、反应体系中的污染物等导致的。该NTC可能含有低水平的污染物，但是污染物的浓度过低，不能产生扩增曲线或熔解曲线。

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问大肠杆菌逆转录可以使用oligoDT吗，我的表达基因上有连续的a，能否使用oligoDT，然后做qpcr

汤姆卜丽波

可以做的，能p出来，只要有一点表达都能p出来

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问qPCR内参Ct值

橙汁儿青柠味

模板cDNA稀释的比较多所以内参的ct值比较大，然后目的基因的表达丰度比较高，所以ct值比内参小

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问设计扩cDNA的引物是否需要去内含子？如何找到一段DNA序列的内含子？

loveliufudan

设计扩增cDNA的引物时，是否需要包括内含子取决于您想要扩增的片段是否跨越了内含子区域。如果您想要扩增的片段跨越了内含子，那么您需要设计跨越内含子的引物。如果您想要扩增的片段不跨越内含子，那么您可以设计内含子保留的引物，这样可以减少设计引物的难度和复杂性。找到一段DNA序列的内含子，可以尝试以下几种方法：基于已知转录本的查询：如果您的实验物种已经有已知的转录本序列，您可以使用在线工具或者本地软件，

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问RNA反转录之后的cDNA跑胶该选择多大的marker?

loveliufudan

一般而言，可以根据已知目标基因的长度来选择 Marker 的大小。如果你希望检测的目标 DNA 片段在 100bp-1000bp 左右，则建议选择 100bp DNA ladder 或者 1kb DNA ladder 作为 Marker。如果你希望检测的目标 DNA 片段比较小，则可以选择 50bp DNA ladder 作为 Marker。因此，选择合适大小的 Marker，能够更好地检测出期望

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问分子互作求教

loveliufudan

如果您使用Octet BLI测定蛋白质相互作用，您可以获得响应图谱，但无法获得类似ELISA那样的结合曲线。不过，通过对响应图谱进行分析，如计算最大响应值、关联常数（Kd）等，您仍然可以评估蛋白质相互作用的强度和特异性。

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问trizol法怎么提取血中rna？

Dr_劉医生

以下是Trizol法提取血液RNA的步骤：提取血液细胞2. 加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。3. 4℃离心，12000g×15min，取上清。4. 加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。5. 4℃离心，12000g×10min，弃上清。6. 加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（6

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问微流控制备双层液滴有什么要点吗？

loveliufudan

以下是一些建议和注意事项，供您参考：1.毛细管的尖端距离：尖端距离需要适中，以保持液滴的稳定性并防止两个液滴之间的过早融合。通常，根据实验液相的流速和流动性，尖端距离可以在0.5至3 mm之间进行调整。建议先使用较大的距离开始尝试，并在实验中逐步调整以获得最佳结果。2.调整流速：在进行液滴制备时，内外相和中间相的流速会影响液滴的形成。请确保内相和外相的流速适中，以使液滴能够在毛细管尖端正常形成。您

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问用人血做pcr，是用血浆还是全血还是血清比较好呢？

汤姆卜丽波

我们一般都是用血清做的，直接采血然后取血清

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问扩增1800bp左右cds区全长扩不出来，如果分段设计引物怎么弄？

loveliufudan

可以尝试分段设计引物来扩增。一般而言，可以根据CDS区域的序列信息，设计多对重叠的引物，将CDS区域分成较短的几段，每段长度不超过1000bp，然后逐段扩增。以下是一些分段扩增的建议：确定CDS区域的边界。可以通过查阅文献、数据库或者基因注释信息等方式获取。分段设计引物。选择多对引物，每对引物的长度应在18-24 bp之间，GC含量应在40-60%之间。引物的Tm值应该尽可能接近，以避免温度差异对

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问定量PCR没有数据，曲线也是乱糟糟，救命啊！！

来一起探讨

可以看看你的反应体系。或者是使用设计的扩增条件。或是看一下所选的荧光通道与试剂是否匹配。

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问PCR扩增之后，体系的微升数会变多吗？

来一起探讨

pcr扩增，高温变性——低温退火——引物PCR扩增仪延伸，体系中的引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 消耗，虽然DNA含量即增加一倍，但是体系不会变多。

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问Pcr阴性对照阳了！！！大佬救命🆘

z流沙z

这个一般是引物或者水混有杂质，可以重新溶解粉末引物试试，然后用新的水或者depc水

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问用trizol法怎么提取血清中的rna？

loveliufudan

Trizol法主要是用于从细胞或组织中提取RNA，而血清中的RNA含量较少，且被其他物质干扰，所以提取血清中的RNA需要特殊处理。以下是一种适用于Trizol法提取血清中RNA的方法：准备血清样品：收集血液，用离心将血液分离成血清和红细胞。将血清取出，可以使用超低温冰箱或液氮进行冻存。加入Trizol：在提取RNA前，将血清样品从超低温冰箱或液氮中取出，加入适量的Trizol试剂，如10%体积比，

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