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        以昆虫cDNA为模板进行PCR无法克隆目的片段

        相关实验:RNA 的提取和纯化实验

        user-title

        dxy_lywi9f05

        用昆虫的cDNA为模板做PCR,无法克隆出目的片段,请问有大神知道怎么解决么?尝试过换酶,换引物,重新提取RNA反转获得cDNA,也还是不行,忙活一个多星期了,连个目的基因片段都扩增不出来,求大神指导指导。

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        3 个回答

        user-title

        桃之zbx

        有帮助
        1. 有可能DNA浓度过低,有没有测过DNA浓度呀
        2. 酶有没有把目的片段切碎呀
        3. PCR的温度和时间调整一下
        4. 直接送公司测一代看看能不能测出来,反馈结果是什么
        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        可以考虑以下几个可能的原因和解决方案:

        可能是目的片段本身存在较高的多态性或特殊的结构,导致PCR扩增困难。可以考虑采用nested PCR、touchdown PCR等特殊的PCR技术来扩增目的片段。

        可能是昆虫的cDNA模板存在较低的质量或者纯度问题。可以尝试更换RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒等,以提高反应效率和特异性。

        可能是PCR反应条件存在问题,例如模板浓度过高或过低、引物浓度过高或过低、反应体系缺失某些关键成分等。可以尝试调整PCR反应体系,包括模板、引物、酶、缓冲液等的浓度和组合,寻找最佳的PCR反应条件。

        可能是PCR反应出现了非特异性扩增或者产生了假阳性条带。可以考虑进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析、克隆测序等方法来确认PCR产物的特异性和正确性。

        可能是目的片段长度过长,超过了PCR扩增的极限。可以尝试使用long PCR技术、特殊引物、增加扩增周期数等方式来增加PCR扩增的效率。


        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        目的基因的片段是多少,调整一下目的基因片段,避免过短或过长,然后再次更换引物,用特异性高的引物来扩增

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