质粒与引物设计篇

1. 如何选择合适的限制酶切位点？

在载体构建实验过程中，限制性酶切位点的选择是决定克隆成功率和后续实是否顺利的关键步骤。选择时需综合考虑载体特性、目的基因序列、酶的反应特性及实验需求，我们可以从以下几个角度分析：

①确保酶切位点在载体和目的基因上均存在且唯一：这是选择的基本要求，避免载体被切成多个片段；

②通过双酶切实现 「定向克隆」，避免反向连接：单酶切可能会导致目的基反向插入载体（该情况会导致表达失败），因此建议优先选择两种不同的限制酶进行双酶切，利用其产生的不同粘性末端（或平末端）实现定向克隆；

③考虑酶的反应条件兼容性：双酶切时，需确保两种酶的反应条件（缓冲液体系、温度、是否有星号活性）是否兼容，从而提高酶切效率；

④需要保证目的基因的阅读框和功能完整：比如构建表达载体时需要通过酶切位点的选择来确保起始密码子与启动子正确衔接与阅读框正确，eg：目的基因的 ATG 需位于载体启动子的下游，且距离合适（通常间隔几个碱基，避免过远影响翻译起始），酶切位点引入的额外碱基需不改变目的基因的阅读框（3 的倍数），否则会导致移码突变，表达错误蛋白。

 

2. 目的片段太大 (>10kb) 克隆困难怎么办？

对于大片段载体构建实验而言，难点在于片段扩增效率低、重组 / 连接困难、质粒稳定性差、容易发生断裂等。需针对这些痛点，从技术路线选择、实验细节优化两方面制定策略，具体方案如下：

①建议首先选择「分段克隆 + 拼接」 策略，降低连接难度；

②大片段克隆的关键在于长片段的扩增，所以需要从源头保证实验成功率，即保证模板完整度，在扩增前确保模板未发生降解；其次优化 PCR 体系，比如选择长片段专用 PCR 酶，通过梯度测试选择最佳模板上样量及退火温度等；

③避免高拷贝载体（如 pUC 系列）：高拷贝会导致大片段质粒复制压力大，易丢失或断裂，优先用低拷贝载体（如 pACYC184，拷贝数 10-15）或大片段专用载体（如 BAC 载体 pBeloBAC11，可容纳 100kb 以上片段，在大肠杆菌中稳定存在）；

④选择合适的连接方法，比如 Gibson 组装（无缝克隆）的方法更适合 10-20kb 大片段的连接，相比传统的 T4 连接的方法，成功率更高，操作更简便；

⑤选择重组缺陷型感受态，提高大质粒的转化效率，如 Stbl3、DH10B 等，此外转化方式也会影响转化效率，比如电转化比化学转化的效率更高。

 

3. 如何设计目的片段引物？

PCR 引物设计，是决定实验是否成功的重要一环，现有的 PCR 设计工具，比如‌Primer-BLAST (NCBI)、Primer Designer Tool (Thermo Fisher)、 Primer3 等都可以针对目标序列设计出相应的引物，可以根据目标序列特征、实验室资源来选择合适的引物设计工具。如果后续通过无缝克隆的方法构建载体，在设计 PCR 引物时，还需要将同源臂序列添加到上下游引物的两端。具体添加方法可参考所用的同源重组酶的说明书并且注意序列的方向。如果后续载体构建使用的是酶切连接的方法，则需要在设计的引物末端添加酶切位点的序列以及保护碱基，此时还需要注意酶切位点的单一性，避免多个酶切位点。

 

4. 如何选择高效的 PCR 扩增体系？

目前 PCR 酶制品不断升级更新，可以大大简化实验流程，提高扩增的成功率。例如 QIAGEN 的 AllTaq 系，可以实现 DNA 片段的超快准确扩增，10 秒即可完成 1kb 以内片段的延伸，对于长片段也可准确扩增。此外，该系列的 Taq DNA 聚合酶利用小分子锁扣（Guard molecular）将 DNA 聚合酶与抗体紧密结合，只有高温条件才能激活 DNA 聚合酶活性，进一步提高了 PCR 产物的特异性。实验无需冰上配置，配置后的反应体系更可在室温下保存 3 天也不影响 PCR 实验结果。

 

内容来源：QIAGEN 凯杰