结果分析篇

1. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒为何有三条条带

通常完整的质粒电泳会看到多个电泳条带，这与质粒的多种形态有关。质粒可以有超螺旋，线性，开环等多种不同的形态，所以在电泳时常看到三条不同大小的条带，而最下面最亮的条带一般为超螺旋条带。

左图为电镜下的质粒形态，可以看到质粒有不同程度的超螺旋形态；右图为质粒电泳图

 

2. 质粒纯度不好

质粒中常见的污染杂质有蛋白质、基因组 DNA、RNA、乙醇等。这些杂质有可能是质粒提取过程中操作不当有关，比如：

①在加入裂解缓冲液后，剧烈震荡导致大肠杆菌基因组 DNA 断裂，进而造成基因组 DNA 残留，此时应按照说明书轻柔翻转操作；

②加入中和缓冲液后，剧烈振荡会造成质粒 DNA 与蛋白交联；

③漂洗时乙醇没有通过离心或者干燥完全去除，从而影响下游的实验。此外避免内毒素残留是转染级以上的质粒需要严格控制的指标，使用 QIAGEN EndoFree Plasmid kit 系列提取质粒，可以把内毒素控制到 0.1EU/ug 以内，并且在操作过程中无需添加额外的操作步骤。

 

3. Nanodrop 检测数据分析、检测浓度虚高

Nanodrop 检测基本原理：盐类多糖及有机溶剂、蛋白、酚类分别在波长 230nm、280nm、270nm 处有最高的吸收峰，核酸在 260nm 处有最高的吸收峰。

因此，可以根据吸收峰对应的数值来对核酸进行定量与纯度检测。以质粒 DNA 为例，A260/A280 应该在 1.8-2.1 之间，如果低于 1.8，则有可能样品中有蛋白质等杂质污染，如果高于 2.1，则有可能有 RNA 污染；而 A260/A230 比值应≈2.0，如果低于 2.0，则有可能样本中有盐类或有机溶剂杂质污染。但是有时 A260/A230 的比值不在预期范围内，对后续的实验影响相对较小，可以灵活分析此数值。

Nanodrop 是通过测量物质对不同波长光的吸收程度来进行分析的，如果样本中有其他相近吸收峰的杂质，则有可能会导致 Nanodrop 检测值虚高。

如果在实验中遇到 Nanodrop 检测质粒浓度很好，但是下游实验总是失败，有可能是 Nanodrop 检测质粒浓度虚高的问题。此时可以考虑通过琼脂糖凝胶电泳检测目的条带灰度比对来粗略估算质粒的浓度，判断是否是 Nanodrop 检测值虚高太多，也可以用 Qubit 或者毛细管电泳再次检测质粒浓度。

 

4. 提取质粒超螺旋比例太低

通常来说，超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态。如果提取质粒的超螺旋比例太低，可以从以下几个方面考虑优化：

①裂解缓冲液添加后，切勿裂解太长时间，不要超过 5 min；

②添加中和缓冲液后操作轻柔，切勿剧烈震荡，否则会导致超螺旋结构断裂为开环或线性形式；

③使用合适的菌株来扩增质粒，比如 endA–菌株；

④挑选多个单菌落进行小量质粒抽提检测，挑选超螺旋比例高的单菌落来扩繁摇菌抽提质粒;

⑤另外，超螺旋的比例还跟质粒序列本身有关，有些特殊的序列，例如 mRNA 模板质粒中的 poly(A) 序列会导致质粒超螺旋比例降低。

 

5. 质粒构建好后不稳定（在菌里容易丢失/重排）怎么办？

通常质粒在大肠杆菌中可以稳定复制，序列不发生突变。而一些重复序列高的质粒或编码一些对大肠杆菌「有毒」的蛋白的序列，则容易出现不稳定的情况。例如：mRNA 的模板质粒，常含有连续 100 个以上的 polyA 尾序列，在复制中，重复序列可能会出现个别碱基的丢失；有些「毒性基因」，如某些表达核酸酶的序列，在质粒复制的过程中有可能会出现微量的「泄露表达」。即使低剂量的表达，也可能会影响大肠杆菌的复制和生长，因此大肠杆菌会努力将其「清除」，也就是这些序列在复制中可能会逐渐「丢失」。

针对上述情况可以考虑从以下方面解决：

①针对编码基因，可以通过密码子优化的方式，降低序列重复性；

②polyA 尾序列中可以引入间隔碱基，减少连续重复碱基的数量，可参考 Moderna 新冠疫苗中的 polyA 尾设计；

③使用一些特殊的感受态细胞，可以兼容一些毒性基因的复制；

④在摇菌培养中，降低培养温度，降低质粒的扩增效率，也可降低质粒的突变效率；

⑤对于一些可能有「泄露表达」风险的序列，也可以添加操纵子元件，抑制泄露表达。

 

6. 何防止质粒被污染？污染后如何处理？

质粒发生污染分两种情况，第一，保存的质粒发生了污染；第二，在质粒抽提之前，大肠杆菌的菌液发生了污染。

如果是抽提的质粒发生了污染，首先建议整管质粒弃用；应重新培养保存细菌，再抽提质粒。若怀疑质粒交叉污染（如多个质粒混合），应重新转化、挑单克隆、测序确认。如果已经没有保存的细菌，则可以将质粒重新转化大肠杆菌，挑选单克隆、摇菌、抽提质粒、测序确认，确认质粒无污染、无突变后，再进行大量培养抽提质粒备用。如果在抽提质粒之前，细菌发生了污染，则重新划线培养，挑选单克隆、摇菌、抽提质粒、测序确认，确认无误后再重新摇菌抽质粒。

常规防止质粒污染的方法有：

①质粒抽提后直接分装冻存，避免同一管质粒反复开管和冻融；

②质粒建议保存到-20℃，尽可能不在 4℃ 长期保存；

③保存的菌液建议加冷冻保护剂（甘油等）放-20℃ 保存，并且做好封口，不建议 4℃ 长期存放；

④每次摇菌培养，从挑选单克隆开始，切勿直接吸取保存的菌液开始摇菌；

⑤单克隆生长的平板不建议 4℃ 长期保存，每次取单克隆应从新鲜培养的培养皿上挑取。

 

7. 如何解读测序结果？常用比对软件推荐

质粒送去测序公司测序后，返回的文件一般有原始峰图文件（.ab1）和序列文件（.seq 或.fasta 等）。原始峰图文件可以用 Chromas 或者 SnapGene 打开，既可以看到序列信息，又可以看到测序的信号强度。序列文件可以用 snapGene 或者 DNAMAN 等软件打开并进行序列比对，也可以使用在线的序列比对软件进行比对，如 BLAST，ClustalW2 / Clustal Omega等。

 

内容来源：QIAGEN 凯杰