🔥 引物设计原理与方法

PCR 反应特异性扩增的一个关键条件是引物的正确设计，使用不合适的 PCR 引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。

合理的引物设计有利于得到特异性的产物

一、引物设计原则

1.引物长度：PCR 的特异性通过引物长度和退火温度控制，一般 16-24 个碱基。

2. G+C 含量：G+C 的含量一般控制在 40-60% 左右。

3.碱基随机分布。为避免 PCR 产物的突变，一般不建议 3' 端连续相同的碱基，并且目的片段的某一序列连续多个相同碱基的位置，极容易出现突变。

二、实验步骤

1.目的片段的获取

设计引物取决于待扩增的目的片段。在 NCBI 首页的搜索框的下拉菜单中选择 Gene，再在对话框中输入目的基因的名称；选择对应的来源之后，选择对应需要的亚型，将其编码基因的 CDS 区域保存。

2.引物的设计

引物设计方法很多。用 Oligo7 软件打开保存的序列，将光标拉至扩增序列的最前端，点击 Edit，里面选择 Edit forward primer，系统默认 21 个碱基，按照 A/undefined2+C/undefined4 计算引物的 Tm 值，一般 Tm 值在 54-64 之间，可根据这个范围调节引物的长度。调整完成之后将这段编辑后的序列按 5'-3' 的方向复制到 Excel 表格中，同样的方法设计后引物并复制到 Excel 表格。

3.引物的调整

按照质粒构建的方法，在前后引物的 5' 端加上酶切序列（T4 连接酶的方法）或 15-20 bp 的载体酶切位点附近的载体序列（同源重组的方法），按照载体上的酶切序列编码情况，还需要在前引物 ATG 起始前加入碱基以免编码错位，以及确认后引物是否需要终止密码子。

1.注意正反向引物都是 5'-3' 的方向；

2.注意前引物中可能存在错码的可能以及后引物的提前终止。

一、PCR 没有产物或二聚体太多

1.引物设计错误，特别是没有注意后引物的方向；
2.调节 PCR 时退火温度；
3.提高模板的质量或模板的使用量；
4.设计新的引物。

二、构建的质粒不能编码基因

1.没有注意前引物的移码突变问题；
2.没有注意后引物终止密码子的问题；
3.排除其他情况下，换载体。