经验优化与高级技巧篇

QIAGEN2025-08-26

1. Qubit 定量与紫外分光光度计定量的区别

在常规实验室对核酸定量的检测中，常会用到紫外分光光度计（或 Nanodrop）和 Qubit 两种检测方法，二者在原理、准确性、操作难易等方面存在显著差异。

①首先两者原理不同，紫外分光光度计基于核酸的紫外吸收特性来实现对核酸的定量：核酸（DNA/RNA）在 260nm 波长处有特异性吸收峰，且吸光度与核酸浓度成正比；Qubit 基于荧光染料与核酸特异性结合的原理来实现对核酸的定量，两者结合后荧光强度与核酸浓度成正比，通过标准曲线校准实现定量；

②Qubit 准确度更高：蛋白质、游离核苷酸、EDTA 等物质在 260nm 处也存在吸收峰，从而影响紫外分光光度计定量的准确度，而荧光染料仅与目标核酸特异性结合，不受其他杂质影响，qubit 成为精准定量的「金标准」；

③Qubit 检测范围更精准：紫外分光光度计检测范围较宽（通常 ng/μL-μg/μL），但低浓度（<10ng/μL）时误差显著，Qubit 可检测 pg/μL-μg/μL 范围的核酸，低浓度下灵敏度远高于紫外法；

④紫外分光光度计操作更简单，成本更低：紫外分光光度计可以直接点样进行定量，无需专业试剂；而 Qubit 法需经加染料、孵育等步骤，再用仪器检测，依赖于专门的染料，仪器价格更贵，成本相对较高；

两者各有各的优势，可根据实验数据要求及实验室条件选择合适的方法，也可结合两种方法兼顾效率与准确性。

2. 质粒中内毒素残留对下游实验的影响

内毒素是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，又叫脂多糖（LPS）。脂多糖对于宿主是有毒性的，当细菌破碎时，会释放到环境中。在细胞转染中，高内毒素会与 DNA 竞争转染试剂，从而减少质粒 DNA 的摄入量，导致转染效率下降。内毒素具有两亲性和负电荷性，性质类似于 DNA，因此在质粒纯化过程中容易伴随质粒一同被纯化出来。在细胞培养中，内毒素可以改变细胞形态，可以与细胞膜上的受体结合，引起免疫反应，激活组织内炎性细胞和炎症因子的释放，影响细胞生长和一些基因表达。因此，在细胞转染中，尤其是一些敏感细胞的转染，使用的质粒需要控制内毒素的残留水平。

图为革兰氏阴性菌细胞壁结构示意图，LPS 的位置

3. 细胞转染用质粒的质量要求？

细胞转染实验中，质粒的质量和纯度是影响转染效率、细胞活性及实验重复性的关键因素，实验的成功关键在于：

①首先保证质粒完整无降解，分子序列正确，避免因构建错误或降解导致转染后无目标蛋白表达，可通过凝胶电泳、测序等手段进行验证；

②超螺旋被认为是一种能够最有效地提高转染效率和目的基因表达量的质粒形态，要求超螺旋比例＞90% 为佳，可通过凝胶电泳进行检测；

③质粒纯度较好，要求不存在蛋白、RNA、盐离子及有机溶剂污染，可通过紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳进行检测；

④内毒素会引发细胞炎症反应，导致细胞凋亡、基因表达异常，尤其对敏感细胞（如原代细胞、干细胞）影响极大。内毒素含量是转染级以上的质粒需要严格控制的指标，常规细胞系可放宽至 < 10 EU/μg，敏感细胞、病毒包装及体内实验需严格控制在 < 0.1 EU/μg。使用 QIAGEN EndoFree Plasmid kit 系列提取质粒，可以把内毒素控制到 0.04 EU/ug 以内，并且在操作过程中无需添加额外的操作步骤。