抗原设计

Annexin法检测细胞凋亡基本与Annexin-V-FLUOS和PI双标记法相同，早期凋亡细胞因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸（PS）暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素（FITC）的连接素V（Annexin V），但细胞仍然保持其细胞膜的完整性，使荧光染料PI不能进入细胞（因为PI只能进入已经破损的细胞膜）；然而，坏死或凋亡晚期的继发性坏死细胞可同时被Annexin与P ...

Fas抗原的检测 Fas（CD95/APO-1）分子已被证实是一种细胞表面的受体，可与Fas配体（FasL）结合，介导细胞凋亡。本法利用抗－Fas－生物素通过蛋白印迹法、流式细胞分析或免疫组化染色检测Fas/Apo-1分子。【样本来源】(1) 单层粘附细胞；(2) 细胞悬液；(3) 组织切片细胞提取物。【材料与试剂】（Roche公司试剂盒）(1) 鼠抗人－Fas-Bioti ...

PCR-SSO HLA分型技术 编码不同型别HLA抗原的基因在其碱基的顺列上存在差异，这种差异能够用序列特异性寡核苷酸探针（SSO）杂交的方法来检测。其原理是根据各种HLA等位基因的碱基序列，通过人工合成与其互补的寡核苷酸，即SSO探针；待测标本基因组DNA中的HLA基因经PCR扩增之后，与SSO探针杂交，通过观察杂交发生与否，来判断待测标本的HLA型别。 传统上PCR-SSO探针 ...

人类白细胞抗原（HLA）是分布在组织细胞表面的一组膜蛋白，它们的基本生物学功能是将抗原信息提呈给T细胞识别，从而启动和调节特异性免疫应答。根据分子结构、组织分布和生物学功能的差异，HLA抗原可以分为二类，即HLA-I类抗原（包括HLA-A、B、C）和HLA-II类抗原（HLA-DR、DQ、DP）。HLA抗原由第六染色体短臂上一组紧密连锁的基因群编码。在群体中，HLA ...

PCR-SSO标本基因组DNA提取 由于DNA分型技术以PCR扩增为基础，对待测标本DNA的量要求不高，下面介绍的是采用微量全血法提取标本DNA，也可以采用其他类型的样本和其他方法提取DNA，但提取DNA的OD260/280比值范围应该为1.8～2.0。（一）基因组DNA提取【试剂配制和仪器要求】（1） EDTA或枸橼酸钠抗凝全血约0.5ml（2） 红细胞裂解液:（0.3 ...

PCR-SSO扩增DNA固定于尼龙膜上【试剂和材料】（1）上述DNA扩增产物（2）尼龙膜（3）变性液：0.4 M NaOH 25 mM EDTA（4）中和液：20 X SSC：3 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠【操作步骤】（1） 取大小适当的尼龙膜，注意正反面，在点样面做好标记，以区分不同的样本。通常PCR-SSO分型需要多张尼龙膜，而每张尼龙膜上可以点多个样本的扩增DNA ...

PCR-SSO预杂交和杂交【材料和试剂】（1） 50 X Denhardt：2.5g聚蔗糖400，2.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP），2.5g牛血清白蛋白（BSA），加蒸馏水250ml。（2） 预杂交液：5XSSPE，5Xdenhardt液，0.5%SDS，100ug/ml变性并裂解的鲑精DNA。（3） 50%甲酰胺（4） 10 X ...

PCR扩增标本的HLA-DR基因（一）扩增引物HLA-DRB1基因扩增引物为：5’-CCGGATCCTTCGTGTCCCCACAGCACG-3’5’-TCGCCGCTGCACTGTGAAG-3’（二）PCR扩增体系（1） 1.0uM 扩增引物（2） 300ng待测样本基因组DNA（3） 2.0U Taq多聚酶（1） 200uM 各 ...

HLA等位基因序列特异性探针（SSO）及其标记（一）DRB1分型SSO探针 根据分辨率的要求选择。常用的DRB1分型的SSO探针见表代号SSO探针的DNA序列（5’-3’）DR特异性L11TTCAAACTTAAGCTGCCACDR1D11CTCATACTTATCCTGCTGCDR2N77TCTGCAGTAGTTGTCCACCDR3H33CTCTTGGTGATAGAAGTATCDR4E58C ...

PCR-SSO洗膜【仪器和试剂】（1） 洗膜液I：2XSSPE，0.5%SDS。（2） 洗膜液II： 0.1XSSPE，0.5%SDS。（3） 恒温水浴摇床（80rpm，有盖，温度可调至65℃）（4） 精确温度计（精度为±0.1℃）（5） 放射检测仪【操作步骤】（1） 杂交完成后，取出尼龙膜，并放入 ...

PCR-RFLP HLA分型技术 限制性核酸内切酶的识别位点具有严格的DNA序列特异性，不同型别HLA抗原的编码基因在DNA序列上存在差异，用一组限制性核酸内切酶对经PCR扩增后的HLA基因片段进行酶切，由于在不同HLA等位基因上限制性酶切位点的分布存在差异，酶切后的PCR产物经凝胶电泳后就会显示不同的电泳带型，借以鉴定HLA基因的型别。图10-2是采用PCR-RFLP技术进行HLA-DR ...

PCR-SSO结果显示与结果分析【仪器和试剂】（1） 感光胶片（2） 带有增感屏的暗合（3） X光片冲洗试剂和设备【操作步骤】（1） 洗膜完毕后，用塑料薄膜将其包好，与感光胶片一起装入带有增感屏的暗合中，在低温冰箱中进行放射自显影。曝光时间需要摸索，通常为数十分钟至数天，视探针的放射性比活和洗膜程度而定。（2） 曝 ...

PCR-SSP HLA分型技术PCR-SSP（sequence specific primer）分型技术是根据编码各种HLA抗原的等位基因的碱基排列顺序，设计并合成与之互补的寡核苷酸作为PCR引物，样本中HLA等位基因能够用相应的引物（即SSP）进行扩增。通过控制PCR反应条件，SSO仅扩增与其互补结合的HLA等位基因，而不扩增其他的等位基因，PCR扩增产物可用琼脂糖凝胶电泳来鉴定。因此，采用S ...

PCR-SSP扩增体系的组成和准备（一）SSP引物混合液的准备预先准备好所有引物的混合液，其中包括除Taq多聚酶和待测基因组DNA之外的所有PCR反应成分，即：（1） 2pmol 5’ 末端和3’末端的引物（2） 2pmol 内参照引物（β-actin基因引物）（3） 200umol 各种d-NTP（dATP，dCTP，dGTP，dTTP）（4） 1 X PCR缓冲液：10mM Tris-HCl ...

HLA-DR基因中等分辨率分型序列特异性引物5’-引物序列(5’ � 3’)3’-引物序列(5’ � 3’)PCR产物长度DRB1基因扩增特异性5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3’047CTGCACTGTGAAGCTCGCAC255bp0101-01023’048CTGCACACTGTGAAGCTCTCCA255bp5’01TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT3 ...

常用HLA DNA分型技术的特点1、PCR-SSOPCR扩增的序列是具有多态性的HLA等位基因外显子，HLA-I类基因主要是第2和第3外显子，HLA-II类基因主要是第2外显子，PCR扩增产物用一组探针进行杂交，每一探针与相应型别的HLA等位基因序列互补。HLA等位基因特异性的探针可以检测已知序列的HLA等位基因。因此PCR-SSO是一种常用而精确的HLA基因分型方法，通常是将多个待测样本的PC ...

抗原特异性T细胞克隆的制备 （一）间歇循环刺激法 是制备抗原特异性T细胞克隆的传统方法，即经抗原间隔刺激多个循环。 【材料和试剂】 （1）抗原致敏供者的单个核细胞(MNC)和经过3300rad照射的自身MNC （2）抗原 （3）含10％人AB型血清的完全RPMI 1640培养液 （4）细胞分离及T细胞培养增殖所需的其他试剂和器材。 【操作步骤 ...

常用HLA DNA分型技术的选用 HLA分型方法的选用首先取决于HLA分型的目的，组织配型中常用的是中等分辨率的分型技术，即分辨出与HLA抗原特异性相对应的HLA等位基因型别，而在某些研究中需要高分辨率的HLA分型，即需要分辨出HLA型别中的各种亚型。上述每一种DNA分型技术的分辨率都高、中、低的区别，在掌握各种分型方法的基本原理的前提下，通过改变SSO探针的组合，或限制性核酸内切酶的组合 ...

T细胞克隆技术 T细胞在机体特异性免疫应答中发挥举足轻重的作用，其特异性识别的靶分子与B细胞（或抗体）明显不同，不是抗原分子上的天然表位，而是由MHC分子提呈的抗原肽（T细胞表位）。由于T细胞识别的这种特点，决定了对其特异性的研究必须考虑抗原肽的性质和提呈抗原肽的MHC分子型别。 T细胞克隆的建立对于T细胞在免疫应答中的功能研究具有重要的意义。由于T细胞上TCR识别的抗原肽需要MH ...

抗原非特异性T细胞克隆的制备 【材料和试剂】 ①PBMC和经过照射的自身PBMC，照射的同种PBMC； ②5μg/ml PHA； ③50U /ml和25U/ml IL-2； ④T细胞分离、培养和计数所需的其他试剂和器材。 【操作步骤】 (1)从PBMC中分离T细胞，将1×105T细胞，5×104经过照射的自身PBMC，10μgPHA和50U IL ...