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        HLA-I重链、轻链的制备(包涵体的制备)

        互联网

        2700
        HLA-I 重链、轻链的制备(包涵体的制备)
         
        此步骤是用原核表达的方法制备HLA-I类分子的重链和轻链,其中重链为HLA-A2分子的α链(胞外段,包括α1至α3功能区),轻链为β2微球蛋白。HLA-A2分子的α链的C端连接有BSP(生物素结合部位),该部位是通过基因重组的方法将BSP序列与HLA-I类分子重链基因连接后,经过原核表达而获得。
        【试剂及配制】
        (1)LB培养基
        (2)0.4M  IPTG
        (3)50mg/ml 溶菌酶
        (4)1.0M  MgCl2
        (5)2mg/ml DNA酶I,溶于50%甘油,75mM NaCl
        (6)Triton-X 100
        (7)1M DTT
        (8)重悬液(PH8.0)50mM  Tris-HCl(PH8.0)25%(W/V) 蔗糖 1mM EDTA 0.1%(W/V) 叠氮钠 10mM DTT(新鲜加入)
        (9)洗涤液I(PH 8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)0.5% Triton-X 100 100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠
        1mM DTT(新鲜加入)
        (10)洗涤液II(PH8.0)50mM Tris-HCl(PH8.0)100mM NaCl 1mM EDTA 0.1% 叠氮钠 1mM DTT(新鲜加入)
        (11)尿素溶液(PH6.0)25mM MES(PH6.0) (维持电解质溶液)8M 尿素 10mM EDTA 0.1mM DTT(新鲜加入)
        (12)HLA-A2重链、β2微球蛋白表达质粒,以及宿主菌。
        【操作步骤】
        (1)         挑取含有目的基因(HLA-A2重链、β2微球蛋白基因)表达质粒的宿主菌单克隆接种入100ml LB培养液。37o C水平振摇过夜。
        (2)         每升含有抗生素的LB培养液中加入12ml饱和菌液,共6升。
        (3)         37o C水平振摇至OD600 =0.6,取1ml菌液(未诱导),离心取菌体沉淀置-20℃冻存。余下的6L菌液中加入0.4M IPTG 6ml,至终浓度为0.4mM,进行诱导。
        (4)         37o C水平振摇4小时,取0.5ml诱导后的菌液,离心取沉淀,置-20℃冻存。
        (5)         诱导后的约6L菌液于4℃离心,4000rpm X 15分钟
        (6)         沉淀重悬于60ml重悬液,分装在两个50ml离心管中,置-80℃冻存。
        (7)         解冻菌液,倒入100ml烧杯,用磁力搅拌器中速搅拌。
        (8)         边搅拌边滴入:1.2ml 50mg/ml 溶菌酶(终浓度=1mg/ml)
                             300ul 1.0M MgCl2 (终浓度=5mM)
                             1.0ml 2mg/ml DNA酶I(溶于50%甘油,75mM NaCl)
                             600ul Triton-X 100(终浓度=1%)
                             600ul 1M  DTT(终浓度=10mM)
        (9)         将盛有细菌裂解物的100ml烧杯置于冰浴中。
        (10)      超声裂菌:将探头插入菌液,使其深度最大,但不要接触烧杯的底部。
        (11)      将超声裂菌器裂菌1.5分钟,每次间隔0.5秒。
        (12)      转移菌液至3个25 X 89mm Beckman 离心管中,在Beckman Cs-15R离心机中用FO 630 转头,以最大速度于4℃离心10分钟。
        (13)      取50ul上清,标记为S1 ,置-20℃冻存。
        (14)      弃上清,加1-2ml洗涤液I。
        (15)      用搅拌棒将沉淀打散,加洗涤液I至15ml,继续搅拌直到沉淀完全分散。
        (16)      置冰浴,用超声裂菌器裂菌1.5分钟,每次间隔0.5秒。
        (17)      重复步骤(12)至(16)。
        (18)      取50ul上清,记为S2 ,余弃去。
        (19)      重复洗涤3次,取上清,记为S3 - S5
        (20)      同上法,用洗涤液II悬浮沉淀。
        (21)      同上法离心,4℃,10分钟。
        (22)      弃上清,沉淀重悬于200-1000μl 双蒸水,一旦白色浆状物形成,立即重悬沉淀于10-30ml尿素溶液中。
        (23)      4℃,10分钟,离心包涵体。
        (24)      转移上清至15ml离心管。
        (25)      取2μl包涵体,加98ul尿素溶液稀释,测240nm-320nm的OD值。
        (26)      计算蛋白浓度,取500-10000nmol蛋白,置离心管中。
        (27)      在液氮中速冻,并保存于-80℃
        (28)      将各时期的样品行SDS-PAGE(10-12%)。共8个样品:诱导前,诱导后,S1 - S5 最终包涵体样品。
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