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        HLA等位基因序列特异性探针(SSO)及其标记

        互联网

        2842
        HLA 等位基因序列特异性探针(SSO)及其标记
         
        (一)DRB1分型SSO探针
            根据分辨率的要求选择 常用的DRB1分型的SSO探针见表
        代号
        SSO探针的DNA序列(5’-3’)
        DR特异性
        L11
        TTCAAACTTAAGCTGCCAC
        DR1
        D11
        CTCATACTTATCCTGCTGC
        DR2
        N77
        TCTGCAGTAGTTGTCCACC
        DR3
        H33
        CTCTTGGTGATAGAAGTATC
        DR4
        E58
        CCAGTACTCCTCATCAGGC
        DR11
        L37
        AGCGCAGGAGCTCCTCCTG
        DR12
        G11
        CTTATACTTACCCTGCCAC
        DR7
        L74
        GTGTCCACCAGGGCCCGCC
        DR8(+1403)
        Y26
        CTGTGCAGATACCGCACCC
        DR9
        V11
        CTCAAACTTAACCTCCTCC
        DR10
        E71
        GGCCCGCTCGTCTTCCAGG
        DR13(1301,1302,1304)
         
         
        DR1(0103)
         
         
        DR4(0402,0414)
         
         
        DR11(1102,1103)
        K71
        CGGCCCGCTTGTCTTCCAG
        DR13-HAG(1303)
        H60
        GTTCCAGTGCTCCGCAGCA
        DR14(1401,1404,1407)
        N37
        AGCGCACGTTCTCCTCCTG
        DR3
         
         
        DR13(1301,02,04,06)
         
         
        DR14(1402,1403,1406)
        D37
        GAAGCGCAAGTCCTCCTCT
        DR2(DRBundefined0101)
        AV86
        GCTCTCCACAGCCCCGTAG
        DR2(DRBundefined02)
         
         
        DR1(0102)
         
         
        DR12
         
        (二)SSO探针标记
            SSO探针标记可以采用放射性同位素标记,也可采用非同位素表记。下面介绍的是采用T4噬菌体多核苷酸激酶将放射性同位素γ-32 P标记在SSO探针上。
        【试剂配制】
        (1)     SSO探针(10pmol/L)
        (2)     10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液:0.5mol/LTris-HCl(pH7.6);0.1mmol/L MgCl2;50mmol/L二巯苏糖醇(DTT);1mmol/L盐酸亚精胺;1mmol/L EDTA(pH8.0)
        (3)[γ-32 P]ATP(比活5000Ci/mmol,10mCi/ml水溶液)     
        (4)T4噬菌体多核苷酸激酶
        【操作步骤】
        (1)配制标记反应混合液
            SSO探针(10pmol/L)              1.0ul
            10XT4噬菌体多核苷酸激酶缓冲液    2.0ul
            [γ-32 P]ATP                        5.0ul
            ddH2 O                             11.4ul
        (3)     在上述反应混合液中加入8单位(约1ul)T4噬菌体多核苷酸激酶,充分混匀,置37℃温育45分钟;
        (4)     温育完毕后,置68℃10分钟,灭活T4噬菌体多核苷酸激酶。
        【注意事项】
        (1)         标记后的SSO探针比活应达到2000Ci/mmol,如果比活性太低,可在标记反应中补加8单位T4噬菌体多核苷酸激酶继续标记。
        (2)         上述标记的SSO探针可直接使用,也可以采用柱层析分离后使用。
        (3)         放射性物质的操作应严格遵守有关规定和采取适当的防护措施。
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