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        Fas抗原的检测

        互联网

        5048

        Fas(CD95/APO-1)分子已被证实是一种细胞表面的受体,可与Fas配体(FasL)结合,介导细胞凋亡。本法利用抗-Fas-生物素通过蛋白印迹法、流式细胞分析或免疫组化染色检测Fas/Apo-1分子。

        【样本来源】

        (1) 单层粘附细胞;

        (2) 细胞悬液;

        (3) 组织切片细胞提取物。

        【材料与试剂】(Roche公司试剂盒)

        (1) 鼠抗人-Fas-Biotin;

        (2) 封闭缓冲液: 0.1mol/L Tris-HCL, 0.1% BSA(w/v), 0.1% Tween 20(v/v)

        (3) POD封闭液:含0.3% H2 O2 的甲醇液;

        (4) 链霉亲和素-POD(10mg/ml)

        (5) 链霉亲和素-荧光素(10mg/ml)

        (6) DAB底物

        【操作方法】

        1、蛋白印迹法(western blotting)

        (1) 准备标本,并经SDS-PAGE分离;

        (2) 将所分离的蛋白转移至PVDF或NC膜;

        (3) 用封闭缓冲液封闭非特异性结合位点,室温1小时,轻柔振摇;

        (4) 用抗-Fas-Biotin(1mg/ml)在含1%BSA的PBS液中室温孵育1小时,轻柔振摇;

        (5) TBST室温洗膜2次,每次10min;

        (6) 在链霉亲和素-偶联物即链霉亲和素-POD中孵育;

        (7) 在大容量的TBST中洗膜4次,每次15min;

        (8) 在DAB中室温孵育5~15min;

        (9) 观察结果。

        2、流式细胞分析法

        (1) 以PBS洗细胞(单层细胞或细胞悬液);

        (2) 在抗-Fas-Biotin(1:20稀释)中孵育细胞;

        (3) PBS中洗细胞2次;

        (4) 于链霉亲和素-荧光素溶液(10mg/ml)中室温孵育30分钟;

        (5) PBS中洗细胞2次;

        (6) 在荧光显微镜下观察结果或用PBS稀释细胞后进行流式细胞分析。

        3、免疫组化法

        (1) 已固定的组织或组织切片于APES-包被的玻片上,37℃干燥过夜;

        (2) 将已干燥的切片置于混合二甲苯(xylol)中脱蜡,以梯度乙醇脱水;

        (3) 将切片置于柠檬酸缓冲液以最高强度微波处理5x5分钟,冷却至室温;

        (4) 将玻片浸入PBS,用PBSA(PBS+BSA)封闭,室温20分钟;

        (5) 如需要,在POD封闭液中封闭内源性POD,室温作用30分钟;

        (6) 加入抗-Fas-Biotin溶液(1:20至1:100稀释),37℃孵育30分钟,

        (7) PBSA洗玻片三次或浸泡洗涤;

        (8) 于链霉亲和素-POD溶液中室温孵育30分钟;

        (9) PBS中洗玻片三次

        (10) DAB底物反应液中孵育直至呈现清晰可见的颜色;

        (11) 苏木素(hemalum)复染,封片,观察结果。

        【结果判断】

        蛋白印迹法:含有Fas抗原的膜成分呈现棕色条带。

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