抗原非特异性T细胞克隆的制备
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抗原非特异性T细胞克隆的制备
【材料和试剂】
①PBMC和经过照射的自身PBMC，照射的同种PBMC；
②5μg/ml PHA；
③50U /ml和25U/ml IL-2；
④T细胞分离、培养和计数所需的其他试剂和器材。
【操作步骤】
(1)从PBMC中分离T细胞，将1×105 T细胞，5×104 经过照射的自身PBMC，10μgPHA和50U IL-2共同加入24孔培养板孔中，总体积为2ml/孔，4d后于各孔换入含50u/ml IL-2的新鲜培养液，继续培养3d。
(2)收集细胞，通过Ficoll-Hypaque分离，吸取界面层细胞以不完全RPMI-1640液洗一次。
(3)有限稀释克隆:取步骤(2)细胞经有限稀释，于96孔板依次加入不同浓度的细胞悬液，同时加入1×105 经过照射的同种PBMC，5μg/ml PHA和25U/ml IL-2，总体积为200μl，亦可用其他丝裂原或CD3单抗代替PHA，同步骤①培养和换液一次，继续培养3d后，吸去上清100μl，补加100μl含经照射的同种PBMC、PHA和IL-2，培养4d。换入含IL-2的培养液继续培养3d。阳性孔细胞可在含IL-2的培养液中继续传代培养及检测其特性。
【注意事项】
上述方法制备的T细胞克隆特异性是未知的
