抗体抗原实验

双抗体夹心ELISA法检测待测样品sTNF-α含量【基本原理】选用两株针对TNF-α分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1（包被抗体）与McAb2（酶标抗体）。先用McAb1包被固相载体，使待测sTNF-α与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2，则形成McAb1-sTNF-α -HRP标记McAb2复合物，再加入HRP底物，则酶催化底物显色，测定样品与标准品光密度值（ ...

双抗体夹心ELISA法检测待测样品sIL-2R含量【基本原理】选用两株针对sIL-2R分子不同位点的单克隆抗体，即McAb1（包被抗体）与McAb2（酶标抗体）。先用McAb1包被固相载体，使待测sIL-2R与之特异性结合，然后再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的McAb2，则形成McAb1-sIL-2R-HRP标记McAb2复合物，再加入HRP底物（邻苯二胺），则酶催化底物而显色，测定样品与标 ...

MTT比色法检测TNF的生物活性【操作步骤】（1）取对数生长期的L929细胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液；（2）用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；（3）将上述细胞悬液加至96孔培养板，100 ul/孔；（4）置37℃，5% CO2培养箱中培养24h；（5）吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入倍比稀释的标准品和待测 ...

ELISA抗原竞争法检测样品中sIL-2R含量【基本原理】本法是用纯化或重组的IL-2R(α链，P55，CD25，Tac抗原)蛋白包被96孔酶标反应板，同时加入已知量的抗IL-2RMcAb，再分别加入sIL-2R标准品与待测样品。则待测sIL-2R或者sIL-2R标准品与包被的纯化或重组的IL-2R蛋白竞争与抗IL-2R McAb结合。通过与标准品对照，从抗IL-2R McAb与包被的纯化或重组 ...

IL-2质粒DNA探针制备的操作步骤（1）含IL-2质粒DNA探针的提取取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基（含100μg/ml Amp）↓37℃ 220r/min 振摇过液(约16h )取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp)↓37℃ 150r/min振摇 4h加氯霉素(终浓度170μg/ml)↓37℃ 220r/min振摇3h菌液倒入300 ...

IL-2质粒DNA探针制备的试剂与仪器（1）含IL-2 DNA探针的质粒以及宿主菌（2）STE 溶液：0.1mol/L NaC1（3）Tris HC1(PH8.0)：10mmo1/L、1mmo1/L（4）溶液I 50mmo1/L 葡萄糖 25mmo1/L Tris HCL(PH 8.0) 10mmo1/L EDTA(PH 8.0) 可配100ml，高压灭菌15 ...

间接免疫荧光法检测样品中mIL-2Rα+阳性细胞 白介素2受体（interleukin 2 receptor， IL-2R）是能与白介素2（IL-2）特异性结合的细胞受体。IL-2R由α、β、γ链组成。IL-2R存在形成包括膜结合型IL-2R（membrane-bound IL-2R，mIL-2R）与可溶性IL-2R（solubble IL-2R，sIL-2R）。sIL-2R是由于某种因素 ...

RNA的斑点杂交--杂交【试剂与仪器】（1） 预杂交液：5×SSC，2×Denhardt液（或采用试剂盒的相应试剂），0.02%(W/V) SDS（2） 杂交液DIG Easy Hyb（3） 杂交袋（4） 含0.1%SDS 2×SSC和含0.1%SDS 0.1×SSC【操作步骤】 （1）预杂交① 先将预杂交液热至60 ...

培养细胞RNA的提取（采用Trizol试剂盒提取RNA）【试剂与仪器】（1） RNA提取试剂：TRIZOL试剂（Gibcol No15596-026）（2） DEPC处理的双蒸水，乙醇（3） RPMI-1640，胎牛血清（FCS），ConA（刀豆蛋白A）（4） CO2培养箱（5） 无菌操作台和离心机等【操作步骤】（1 ...

斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量免疫测定【试剂与仪器】地高辛标记和检测试剂盒（Boerhinger Mannheim，No1093657）【操作步骤】（1） 杂交后彻底清洗，将膜置入清洗缓冲液中1～5min；（2） 100ml封闭缓冲液（1×）中封闭30min；（3） 抗地高辛-AP复合物（75mu/ml）用封闭缓冲液（1×）1：10 ...

苏木素-伊红染色法（HE染色法）检测细胞凋亡 凋亡检测中形态学方法是最直观、可靠的方法之一。对组织和各种细胞进行染色后，在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察，通过观察细胞的形态或染色的类型来判断凋亡的发生与否。【材料及试剂】（1）苏木素液：先将2.5g苏木素溶于25.0ml乙醇中，再将预先已溶有2.5g明矾的蒸馏水500ml加入苏木素乙醇溶液中，煮沸后将火焰熄灭，慢慢加入1.25g氧 ...

细胞样本的制备、固定及增加其通透性【试剂及设备】（1） 培养基；不含酚红的DMEM培养基（2） 处理玻片：将多聚赖氨酸溶液（溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液中），涂布于玻片上，干燥后即可使用。或者APES 2ml溶于100ml丙酮中，将玻片浸泡入内，取出晾干，180℃干燥备用。（3） 洗涤液；0.1M，pH7.2～7.4PBS（ ...

原位杂交法测定TNF的mRNA原位杂交【试剂及配制】（1） TNF-DNA探针（2） 地高辛标记液试剂盒（3） 杂交液：60%去离子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2PO4(pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl变性鲑精DNA（4） 设备： ...

瑞氏（wright）染色法检测细胞凋亡【材料与试剂】Wright染液：称取Wright粉剂0.1g在碾钵内，充分碾磨，量取甲醇60ml，逐步加入，边加边碾磨，直到染料全部溶解，置试剂瓶中密封，1周后可用。Wright磷酸盐缓冲稀释液：Wright染液10 ml，磷酸盐缓冲液20ml。磷酸盐缓冲液：磷酸二氢钾6.63g，磷酸氢二钠2.56g，蒸馏水1000ml。染色缸，离心涂片机，离心机，显微镜。 ...

Hoechst33258（或Hoechst33342）染色法检测细胞凋亡【材料与试剂】Hoechst33258染液：称取Hoechst33258（或Hoechst33342）1mg，用20ml蒸馏水溶解，过滤，4℃避光保存。用时用蒸馏水10倍稀释成染色液，pH7.0。固定液：4%多聚甲醛。荧光显微镜。【操作方法】将制备好的石蜡切片按常规脱蜡、水化，用PBS洗5min；或冰冻切片用冰丙酮固定15 ...

Hoechst/PI双标记法检测细胞凋亡 凋亡细胞在等渗条件下进行活细胞染色，其吸收Hoechst的能力增强。因此，在活细胞中加入Hoechst染料，凋亡细胞很快产生较强的蓝色荧光，其强度要比坏死的和活的细胞大得多。Hoechst/PI双标记法是目前细胞凋亡最满意的形态学分析方法。先用Hoechst进行活细胞染色，再进行PI染色，并与细胞光散射性质测定结合起来。Hoechst/PI双标记法 ...

AO染色法（丫啶橙染色法）检测细胞凋亡【材料与试剂】pH4.8～6.0 Tritionx-100的PBS缓冲液， AO染料：将AO染料溶于含1%TritionX-100的PBS中，终浓度为6μg/ml，含Rnase100μg/ml，避光保存。荧光显微镜【操作方法】制备活细胞悬液106/ml；取95μl细胞悬液，加5μl的AO染液混合、避光作用10min；加入5ml PBS，1500r/min离 ...

Annexin-V-FLUOS和PI双标记法检测细胞凋亡 凋亡早期，细胞表面可发生改变，细胞膜的改变之一是磷脂酰丝氨酸（PS）从胞膜内转移到胞膜外层，从而使PS暴露在细胞表面。在凋亡发生时，巨噬细胞能特异性识别暴露在细胞表面的PS，从而吞噬凋亡细胞和凋亡小体，使机体免于细胞内容物释出所引起的炎症反应和伴有的组织细胞坏死。Annexin-V 是一种Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，与PS有高度亲 ...

基于凋亡诱导蛋白酶变化的细胞凋亡检测 半胱-天冬氨酸蛋白酶家族（cysteinyl aspartate specific protease，Caspase）是近几年人们发现的与ced-3同源的一类蛋白酶，具有10余种成员。“C”代表半胱氨酸在酶的活性中心，“aspase”代表其底物切割蛋白作用位点都在天冬氨酸羧基端，这是caspase家族最为独特的催化活性。Caspase一般以非活化的酶 ...

蛋白酶PARP的测定检测细胞凋亡 聚（腺苷二磷酸-核糖）多聚酶（PARP）为一种依赖Zn2+的真核DNA结合蛋白，可特异性地识别DNA断裂末端并结合， 是一种重要的DNA修复酶。在细胞凋亡发生的早期， PARP是caspase家族（如caspase3 和7）的作用底物，后者可使PARP的DNA 修复功能丧失。Caspase可将 113kD的PARP水解为89kD和24kD的两个片断。 本方 ...