斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量免疫测定
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斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量免疫测定
【试剂与仪器】
地高辛标记和检测试剂盒（Boerhinger Mannheim，No1093657）
【操作步骤】
（1） 杂交后彻底清洗，将膜置入清洗缓冲液中1～5min；
（2） 100ml封闭缓冲液（1×）中封闭30min；
（3） 抗地高辛-AP复合物（75mu/ml）用封闭缓冲液（1×）1：10000稀释；
（4） 稀释的抗体溶液20ml与膜孵育30min；
（5） 100ml清洗缓冲液中2次，每次15min；
（6） 20ml测定缓冲液中平衡2～5min；
（7） 将膜置入新鲜制备的20ml显色液中孵育5min(暗处，即避光)，显色过程中避免振动；
（8） 数分钟显色沉淀开始形成，16h后反应完全，可短期在亮处观察显色情况；
（9） 如果可见期望的斑点，加TE缓冲液50ml作用5min终止显色。
图像分析结果
采用MPIAS-500多媒体彩色图文分析系统，以0.758um波长取样。在1.715×105 um2 测量窗下测得各斑点的积分光密度值，以标准品的相应参数作图，查得各样本的数值，或将各组织分光密度值进行比较，得出样本相应mRNA含量。
也可以用其他型号的光密度扫描仪进行扫描，检测每点的光密度，与标准品光密度曲线比较，得出样本相应mRNA含量。
