原位杂交法测定TNF的mRNA
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原位杂交法测定TNF的mRNA
原位杂交
【试剂及配制】
（1） TNF-DNA探针
（2） 地高辛标记液试剂盒
（3） 杂交液：60%去离子甲酰胺，300mmol/L NaCl、30mmol/L柠檬酸钠、10mmol/L EDTA 25mmol/L NaH2 PO4 (pH7.4)，5%葡聚糖硫酸酯，250μg/μl变性鲑精DNA
（4） 设备：温箱，水浴锅，加样器，吸头，染色缸等
【操作步骤】
（1） 用地高辛标记DNA探针，参见上面介绍的“斑点杂交法测定培养细胞IL-2 mRNA的含量”；
（2） 准备杂交液；
（3） 临用前，将DIG标记的DNA探针在80℃加热10分钟，迅速置冰浴中变性后，将其加入杂交液中，至终浓度5μg/μl；
（4） 将10-20μl杂交混合液（杂交液加变性探针）加入到固定并增加了通透性的细胞上，盖上专用原位杂交盖玻片，放入盛有约20ml 20%甘油湿盒内37℃使其杂交过液。
洗涤
【试剂及配制】
（1） 2×SSC：1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g，柠檬酸三钠（C6 H5 O7 NA3 ・2H2 O，分子量294）8.8g；
（2） 0.5×SSC：300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可；
（3） 0.2×SSC：270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可
【操作步骤】
揭掉盖玻片，30-37℃左右水温的2×SSC洗涤5min×2次，0.5×SSC洗涤15min×1次，0.2×SSC洗涤15min×1次。
荧光抗体检测
【试剂及配制】
（1） 封闭液：Tris-HCl 100mmol/L PH7.5，NaCl 150mmol/L，0.5%羊血清。
（2） 抗DIG-荧光素抗体
（3） 洗涤液：0.1M，pH7.2～7.4PBS。
（4） 20%甘油：20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
（5） 乙醇：70% 90% 100%
（6） 防退色溶液：九份甘油与一份染液（1mmol/L Tris-HCl pH7.5，2% 1.4-diaza-bicyclo[2，2，2]-Octane，500ng/ml propidiumiodide）
（7） 地高辛标记和检测试剂盒
（8） 设备：加样器，吸头，染色缸等
【操作步骤】
（1） 每块载玻中上加100μl封闭液，封闭非特异性结合位点；
（2） 用封闭液将抗DIG-荧光素抗体按1：500稀释加在载玻片上，置湿盒内37℃温育45min，用洗涤液洗5min×4次；
（3） 用100mol/L Tris-HCl（pH7.5），150mmol/L NaCl，0.05% Tween 20洗载玻片；
（4） 将细胞样品依次在70%，90%，100%乙醇浸泡5分钟，脱水；
（5） 将玻片在空气中干燥；
（6） 将细胞样品放在防退色溶液中，取出封片。
结果观察
表达TNF mRNA的细胞胞浆着色，在荧光显微镜荧光的分布与强渡。
