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        IL-2质粒DNA探针制备的操作步骤

        互联网

        2130
        IL-2 质粒DNA探针制备的操作步骤
         
        (1)含IL-2质粒DNA探针的提取
        取含IL-2质粒DNA的单个菌落置两个25ml LB培养基(含100μg/ml Amp)
        ↓37℃  220r/min 振摇过液(约16h )
        取10ml菌液加200ml LB培养液(含100μg/ml Amp)
        ↓37℃ 150r/min振摇 4h
        加氯霉素(终浓度170μg/ml)
        ↓37℃ 220r/min振摇3h
        菌液倒入300ml离心管中离心
        ↓4℃ 5000r/min×10min离心弃上清除去残液(吸水纸无菌)
        每管加40ml STE溶液(冰预冷)悬浮细菌后,用移液管转入到50ml离心管中
        ↓4℃ 5000r×15min离心
        弃上清,加5ml溶液1(冰预冷)悬浮细菌,加1 ml新配制(pH8.0)的溶菌酶(10g/ml)
        ↓轻摇,室温静置5min
        加10ml溶液II,盖上盖子,将离心管小心颠倒数次混合液体,不要用旋涡振荡器
        ↓冰浴10min,且勿摇动
        加7.5ml溶液III(冰预冷)摇振荡离心管数次使之混合
        ↓冰浴20-30min,使沉淀完全,4℃ 12000r/min×20min离心
        取上清到另一50ml离心管中,加0.6体积异丙醇,混匀、室温静置15min
        ↓室温5000r/min×15min离心弃上清
        用75%乙醇洗涤沉淀一次(不将沉淀悬浮),将乙醇倒置吸水纸上,使乙醇挥发
        用1.5m1TE(pH8.0)将沉淀溶解加等体积冰预冷的5MLiCl,混匀后置冰溶10min
        ↓4℃12000r/min×10min离心
        取上清至新EP管,加等体积的异丙醇(约3ml)充分混合、室温静置15min
        ↓室温12000rmin×10min离心(回收沉淀的核酸)
        小心去上清,将管倒置以使最后残留的液滴流尽,用75%乙醇洗涤沉淀,流尽乙醇,用吸低吸去附于管壁的液滴,将管倒置在纸巾上数分钟,以使最后残余的痕量乙醇蒸发
        ↓加入RNA酶(终浓度100μg/ml)用500u1TE溶解沉淀DNA,移至新EP管中
        ↓37℃水浴30min
        加等体积(500ul)含13%(W/V)PEG(800)的1.6mol/L NaCl,充分混合
        ↓4℃ 12000r/min×5min离心
        吸去上清用400u1TE(PH8.0)溶解质粒DNA沉淀
        加等体积饱和酚(400ul)混合
        ↓12000r/min×10min离心
        吸上层水相移至另一EP管加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)剧烈混匀至乳白状
        ↓12000r/min×10min离心
        吸上层水相移至另一EP管,加等体积氯仿:异戊醇(24:1)混匀
        ↓12000r/min×10min离心
        吸上层水相移至新EP管(硅化)、加入0.1体积的3mol/L NaAC(pH5.2)和2体积的-20℃,预冷的无水乙醇、混匀(可见沉淀出现),置-20℃2h或0℃20min
        ↓4℃12000r/min×15min离心
        弃上清,加75%乙醇(4℃预冷)200u1,稍加振荡,离心洗涤2次
          ↓4℃12000r/min×5min离心去上清.
        敞开管口,将管置于实验桌上直到最后可见的痕量与乙醇挥发.
          ↓
        溶沉淀于11μlTE溶液中
             ↓                 ↓
           取1μl电泳       其余进行酶切
        (2) 经0.7%琼脂凝胶电泳,确定有质粒DNA后,用XhoI进行酶切.
        酶切反应体系:10μl质粒DNA,6μl内切酶XhoI,6μl 10 X酶切缓冲液,38μl蒸馏水,总体积为60μl;37℃消化过液。
        (3) IL-2 DNA片段的回收和纯化
            可以使用任何一种回收与纯化DNA片段的方法,下面介绍的是用WizardTN PCR纯化试剂盒回收IL-2 DNA片段。
        1)将60μl酶切反应体系经1%琼脂糖凝胶电泳;
        2)紫外灯下切下IL-2 DNA片段,挑出凝胶到EP管中,加1 ml Resin,使凝胶深化;
        3)用5ml一次性注射器将Resin/DNAmix转移到Wizard Minicolumn中,
        4)用2ml80%异丙醇洗涤Minicolum;
        5)12000g离心20min;
        6)将Minicolumn转移至新EP管中,加50ul3三蒸水到Minicolumn中,12000g离心20S,收集DNA。
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