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        瑞氏(wright)染色法检测细胞凋亡

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        瑞氏(wright)染色法检测细胞凋亡
         
        【材料与试剂】
        Wright染液:称取Wright粉剂0.1g在碾钵内,充分碾磨,量取甲醇60ml,逐步加入,边加边碾磨,直到染料全部溶解,置试剂瓶中密封,1周后可用。
        Wright磷酸盐缓冲稀释液:Wright染液10 ml,磷酸盐缓冲液20ml。
        磷酸盐缓冲液:磷酸二氢钾6.63g,磷酸氢二钠2.56g,蒸馏水1000ml。
        染色缸,离心涂片机,离心机,显微镜。
        其它:甲醇,0.08%醋酸,中性树胶。
        【操作方法】
        收集细胞(1×106 ),PBS洗1次;
        将以上细胞涂片或用离心甩片机制成细胞甩片;
        用甲醇固定3~5min;
        将标本玻片插入 Wright染液缸中染色2 min;
        再插入Wright磷酸缓冲稀释液染色4~10min,用蒸馏水冲洗。如果颜色太深,可用0.08%醋酸分化数秒钟;
        晾干,用中性树胶封片;
        【结果判断】
            正常细胞核染成深蓝色或蓝紫色,色泽均一,凋亡细胞可见核固缩,破碎,染色变深,细胞膜皱缩,出泡,出现凋亡小体。
        (三)Giemsa(姬姆萨)染色法
        【材料与试剂】
        姬姆萨染色液的配制:称取姬姆萨染料0.8g,加入50ml甲醇,加温至58℃,搅拌约2h待染料彻底溶解后,缓慢加入50ml甘油,充分摇匀,置37℃温箱中保温8~12h。然后置棕色瓶中密封保存,即为姬姆萨原液,一般在12~24h后即可使用。临用时,取1ml姬姆萨原液与10ml PBS(pH7.4)混合,即为姬姆萨工作液。
        甲醇和PBS(pH7.4)
        离心机,离心涂片机,显微镜,染色缸。
        【操作方法】
        细胞悬液于1000r/min离心10min,去除上清后,将细胞重悬于PBS中,使细胞浓度为1×106 个/ml;
        取50~100μl细胞悬液均匀涂布于载玻片上或用离心涂片机制片,室温晾干后用甲醇固定1min,晾干;
         在细胞上滴加两滴姬姆萨染色工作液,室温染色5min,用水轻轻洗去染液,室温晾干;
        【结果判断】
            凋亡细胞皱缩,胞膜完整,胞浆稀少或缺乏,染成淡红色;染色质凝聚,染成深紫色;细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒。
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