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        RNA的斑点杂交--杂交

        互联网

        10838

        [试剂与仪器]

        (1)预杂交液:5×SSC,2×Denhardt液(或采用试剂盒的相应试剂),0.02%(W/V)SDS

        (2)杂交液DIGEasyHyb

        (3)杂交袋

        (4)含0.1%SDS2×SSC和含0.1%SDS0.1×SSC

        [操作步骤]

        (1)预杂交

        ①先将预杂交液热至60℃;

        ②将带有目的RNA的硝酸纤维素膜放入稍宽于滤膜的杂交袋,加入预杂交液,按每100cm2滤膜加20ml;

        ③尽可能除净袋中的空气,用热封口器封住袋口,将其置60℃水浴过夜,其间不断翻动塑料袋

        (2)杂交

        ①杂交液DIGEasyHyb(20ml/100cm2)预温轻振荡30min;将标记探针DNA(5~25ng/ml)煮沸变性5min,迅速置冰水中冷却

        ②加入到预温的D1GEasyHyb(2.5ml/100cm2)中混合,避免形成气泡;

        ③探针/D1GEasyHyb注入杂交袋中,封好杂交袋;

        ④68℃振荡孵育至少6h,在微量DNA时建议16h,使其杂交;

        ⑤2×SSC,0.1%SDS清洗2次,每次5min室温;

        ⑥68℃振荡条件下,0.1×SSC,0.1%SDS清洗2次,每次15min。

        [注意事项]

        (1)中和:尤其是计划使用硝纤膜时,凝胶中和后需查一下pH值,pH值应小于9.0,否则会导致膜变黄和破坏。尼龙膜可以承受更高的pH值。

        (2)转移:最好选用尼龙膜(带正电荷)。处理膜时绝对小心,不能将指痕印在膜上,只能用无齿镊夹边角位置。

        (3)固定:转膜后的DNA必须固定才能用于杂交。方法有二,其一是紫外光照射;其二是120℃烘烤30分钟(尼龙膜)或180℃真空烘烤2小时(硝纤膜)。相比之下,照射更为简便。

        (4)标记和杂交的各种溶液应高压灭菌;含SDS,Tween20的溶液应经滤膜除菌后加入其它溶液;使用灭菌吸头,干净器皿,每次用前必须严格清洗。操作膜时戴无尘手套;只用无齿镊操作膜的边缘。

        (5)探针浓度探针浓度是非常重要的因素,应予高度重视。浓度过高会增加背景,浓度过低又会导致敏感性下降。应通过模拟杂交试验来确定最佳浓度。

        (6)可用β-actin作为内参考对照。

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