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        细胞样本的制备、固定及增加其通透性

        互联网

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        [试剂及设备]

        (1)培养基;不含酚红的DMEM培养基

        (2)处理玻片:将多聚赖氨酸溶液(溶于1mol/L pH7.0 Tris-HCl缓冲液中),涂布于玻片上,干燥后即可使用。或者APES 2ml溶于100ml丙酮中,将玻片浸泡入内,取出晾干,180℃干燥备用。

        (3)洗涤液;0.1M,pH7.2~7.4PBS

        (4)细胞固定液:4%多聚甲醛0.1MPBS(pH7.2~7.4)含有1/1000 DEPC

        (5)乙醇:70% 90% 100%

        (6)胃蛋白酶溶液:用0.1N HCl将其稀释为100μg/m

        (7)设备:烤箱,CO2 培养箱,倒置显微镜,玻璃载玻片(经洗涤,180℃干烤或15磅高压灭菌20min,原位杂交专用盖玻片,温箱,加样器和吸头等。

        [操作步骤]

        (1)在37℃5% CO2 条件下将细胞加在处理的载玻片上,用培养基培养,时间通过预实验确定;

        (2)细胞长好后,用洗涤液洗2分钟×3次,室温下将其放入细胞固定液中固定30-60min,蒸馏水洗涤;

        (3)室温下用洗涤液充分洗涤固定细胞,(干燥后-20℃冰冻保存2周以上)

        (4)杂交前将固定的细胞进行如下处理;依次在70%,90%,100%的乙醇中浸泡,脱水每次5min,用二甲苯洗涤,除去残留脂质依次在100%,90%,70%乙醇中浸泡,进行再水化,每次5min,最后浸泡于洗涤液中;

        (5)在37℃用胃蛋白酶溶液10min处理固定的细胞,以增加细胞对大分子试剂的通透性,再用洗涤液洗5min;

        (6)用1%甲醛固定10min,用洗涤液洗净。

        [注意事项]

        (1)所有溶液都必须用RNA酶抑制剂处理。

        (2)操作中最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响

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