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操作演示

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操作演示——解离成年小鼠脑组织用于单细胞测序研究

组织获取——样本制备——磁分选——下游应用

1、质粒的概念质粒（Plasmid）是一种存在于细菌、酵母等微生物细胞中的小型环状双链 DNA 分子，能够独立于宿主染色体进行自我复制，并通常携带对宿主生存非必需但具有特定功能的基因（如抗生素抗性基因）。质粒是分子生物学和基因工程中最重要的工具之一。 质粒根据其用途可以分为多种不同的类型，如用于保存序列信息的克隆质粒（如：pUC 系列质粒），用于表达蛋白的质粒（如哺乳动物细胞表达所用的 pcDNA3.1 系列质粒），用于基因编辑的质粒（如哺乳动物细胞基因编辑所用的 espCas9-2A-GFP 等）以及其他应用的质粒。根据质粒的拷贝数不同，又可以分为高拷贝质粒（质粒可以在细胞内复制成几百个拷贝）和低拷贝质粒（质粒在细胞内只有＜20 个拷贝）。质粒的拷贝数通常受到复制子的调控。质粒上通常会带有多种元件，例如，复制起始位点（ORI），抗性基因，多克隆位点，启动子，终止子，标签序列等等。质粒上至少要带有复制位点（ORI），否则无法进行复制；除了一些特殊质粒（如 minicircle plasmid）之外，绝大多数质粒都带有抗性基因，用于抗生素筛选。多克隆位点可以通过酶切，酶连或者同源重组插入

内容概括：1）质粒提取的量不足；2）质粒纯度低；3）Nanodrop检测值虚高；4）质粒超螺旋比例太低；5）质粒酶切切不开或者有杂带；6）质粒转染细胞效率低；

内容概括：1）质粒抽提的原理；2）质粒抽提--细菌培养；3）质粒抽提--裂解；4）质粒抽提--纯化；5）质粒抽提--质量检测；

内容概括：1）质粒的基础知识；2）质粒载体的构建流程；3）片段重组的构建方案；4）质粒载体构建的常见问题分析

1. Qubit 定量与紫外分光光度计定量的区别在常规实验室对核酸定量的检测中，常会用到紫外分光光度计（或 Nanodrop）和 Qubit 两种检测方法，二者在原理、准确性、操作难易等方面存在显著差异。①首先两者原理不同，紫外分光光度计基于核酸的紫外吸收特性来实现对核酸的定量：核酸（DNA/RNA）在 260nm 波长处有特异性吸收峰，且吸光度与核酸浓度成正比；Qubit 基于荧光染料与核酸特异性结合的原理来实现对核酸的定量，两者结合后荧光强度与核酸浓度成正比，通过标准曲线校准实现定量；②Qubit 准确度更高：蛋白质、游离核苷酸、EDTA 等物质在 260nm 处也存在吸收峰，从而影响紫外分光光度计定量的准确度，而荧光染料仅与目标核酸特异性结合，不受其他杂质影响，qubit 成为精准定量的 「金标准」；③Qubit 检测范围更精准：紫外分光光度计检测范围较宽（通常 ng/μL-μg/μL），但低浓度（<10ng/μL）时误差显著，Qubit 可检测 pg/μL-μg/μL 范围的核酸，低浓度下灵敏度远高于紫外法；④紫外分光光度计操作更简单，成本更低：紫外分光光度计可以直接点样

1. 琼脂糖凝胶电泳检测质粒为何有三条条带通常完整的质粒电泳会看到多个电泳条带，这与质粒的多种形态有关。质粒可以有超螺旋，线性，开环等多种不同的形态，所以在电泳时常看到三条不同大小的条带，而最下面最亮的条带一般为超螺旋条带。左图为电镜下的质粒形态，可以看到质粒有不同程度的超螺旋形态；右图为质粒电泳图2. 质粒纯度不好质粒中常见的污染杂质有蛋白质、基因组 DNA、RNA、乙醇等。这些杂质有可能是质粒提取过程中操作不当有关，比如：①在加入裂解缓冲液后，剧烈震荡导致大肠杆菌基因组 DNA 断裂，进而造成基因组 DNA 残留，此时应按照说明书轻柔翻转操作；②加入中和缓冲液后，剧烈振荡会造成质粒 DNA 与蛋白交联；③漂洗时乙醇没有通过离心或者干燥完全去除，从而影响下游的实验。此外避免内毒素残留是转染级以上的质粒需要严格控制的指标，使用 QIAGEN EndoFree Plasmid kit 系列提取质粒，可以把内毒素控制到 0.1EU/ug 以内，并且在操作过程中无需添加额外的操作步骤。3. Nanodrop 检测数据分析、检测浓度虚高Nanodrop 检测基本原理：盐类多糖及有机溶剂、蛋白、

1. 质粒载体构建不成功（目的片段和载体不能成功连接）的常见原因分析①DNA 片段纯度差：体系中的杂质会降低连接效率，如果使用不纯化直接连接的方法一直无法成功构建载体，可以考虑进行纯化后再进行连接；②目的片段和载体片段使用比例悬殊，或者用量过多或过少：目的片段和载体的摩尔比需要控制在一定范围之内，否则会影响连接效率，具体比例可以草靠连接酶说明书；③连接条件不当：比如连接时间不足、温度不合适、酶失活等，可以通过设置对照组来排查原因；④引物设计问题：比如通过无缝克隆的方式进行连接，同源臂区域如果 GC 含量过高过低，或者有重复序列，都可能在核酸外切酶切割后形成发卡结构，影响重组效率，可以使用质粒设计软件来检查同源重组臂的设计。⑤插入序列本身的问题：有些序列本身存在连接载体困难、连接产物不稳定、连接产物在大肠杆菌中复制困难等问题。对于这类序列可以考虑将序列打断后分步构建，或者更换载体或感受态的方式尝试解决。2. 质粒提取量不足质粒提取量少常见的原因可能是：①摇菌时间过长：大肠杆菌生长已经超过对数期，细菌老化，导致细胞和 DNA 降解。②摇菌时间不足：细菌生长不充分，不能得到足够的菌量来抽提质

高分辨率转录组和蛋白组的整合研究

单细胞和空间组学课题研究思路及案例分析

基于 FFPE 样本的时空多组学解决方案

肿瘤细胞的异质性与状态转换作为肿瘤生物学的核心特征，承载着极为关键的生物学意义。肿瘤并非单一克隆细胞的简单堆砌，其内部存在着显著的遗传变异与表观遗传重塑，而这些变化又进一步驱动了细胞状态及功能的多样化。

前言：肿瘤研究的核心科学问题：挑战与复杂性交织的生命谜题 肿瘤，这一古老而顽固的生命之敌，其发生、发展与演化的复杂性远超想象。理解肿瘤，本质上是解析一个在时空维度上动态演化的异常生态系统。其核心科学问题构成了一座座亟待征服的科学高峰： 肿瘤异质性的本质与根源：肿瘤绝非单一克隆的简单堆积。其内部存在惊人的遗传变异（驱动基因突变、拷贝数变异、染色体不稳定性）、表观遗传重塑（DNA 甲基化、组蛋白修饰改变）以及由此驱动的细胞状态（干性、分化、间质化、代谢状态）和功能（增殖、侵袭、迁移、治疗抵抗）的多样性。这种异质性如何在肿瘤进化树中产生（分支进化 vs. 线性进化）？微环境压力（如免疫攻击、缺氧、营养剥夺）如何塑造和选择不同的克隆或亚群？肿瘤干细胞在维持异质性和驱动复发转移中扮演何种角色？理解异质性层次（瘤内、瘤间、原发灶与转移灶间）及其动态变化，是破解肿瘤可塑性、治疗抵抗和转移扩散的关键。 肿瘤微环境（TME）的构成、功能及其双向互作：肿瘤并非孤立存在，而是深嵌于一个由免疫细胞（T 细胞、B 细胞、NK 细胞、巨噬细胞、髓系抑制细胞等）、基质细胞（成纤维细胞、内皮细胞、周细胞）、神经细胞、

人类的前额叶皮层 (PFC) 不成比例地扩大，负责高级认知和执行机能。它的运转失灵可能导致精神疾病，如精神分裂症和阿尔茨海默病。人们对小鼠 PFC 进行了积极研究，但它缺乏与颗粒状额叶皮层相对应的区域，这表明它与灵长类动物存在巨大的结构性差异。因此，我们的研究小组正在使用狨猴这种原产于南美洲的小型猴子作为灵长动物模型。 在这项实验中，我们研究了 PFC 与丘脑网状核 (TRN) 之间的相互作用，后者是丘脑周围的一组抑制性神经元。TRN 就像一扇门，控制着从大脑皮层向丘脑的信息传输。我们研究了 TRN 中轴突纤维的详细形态，它们将信号从 PFC 传递到丘脑。 图 1. 显示神经轴突如何从前额皮质通过丘脑网状核进入丘脑的示意图。丘脑网状核起着通往丘脑大门的作用。 1.采用简单工作流程的宏观到微观成像起源于 PFC 的轴突纤维以厚束形式穿过一个叫作内囊的通道。这个轴突束穿过 TRN 的前部进入丘脑，在那里通过分裂和重新定向呈现出复杂的形态。为了准确识别 TRN，我们使用了 PV（小白蛋白）作为标记物（图 1）。 FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜的宏观到微观功能可无缝连接

1.在降低漂白的同时对精细和复杂组织结构进行成像由于神经和血管在狭窄区域内形成了复杂结构，所以很难对膝关节骨骺中的血管和感觉神经进行成像。FLUOVIEW FV3000 共聚焦显微镜利用其高检测灵敏在低激光下对精细结构进行明亮的高分辨率成像，从而有助于降低对样品的光漂白。利用 FV3000 显微镜这一特点，我们成功对穿透胫骨骨骺椎孔的复杂 3D 结构的感觉神经及其周围血管进行成像。 图 1. 感觉神经和周围脉管系统穿透胫骨骨骺椎孔（3D 图像）。感觉神经（EYFP，青色）；血管（Alexa Fluor 594，洋红色）；细胞核（DAPI，橙色）。 成像设备：显微镜：FLUOVIEW FV3000 共聚焦显微镜系统 奥伟登（Evident）现已推出全新共聚焦显微镜物镜：100 倍硅油物镜（UPLSAPO100XO） 2.观察胫骨骨骺的神经血管结构了解膝关节的血管和神经投射对于缓解膝关节病疼痛非常重要。然而，研究人员至今仍然无法全面观察感觉神经和血管贯穿整个膝关节的精细结构。利用 FV3000 共聚焦显微镜，我们首次清晰地观察到这些结构。我们发现，膝关节感觉神经不仅存在于半月板，也存在

NanoBiT 是一种结构互补报告分子系统，可用于 PPI 的细胞内检测。它已成功应用于药物筛选、信号传导分析和病毒感染机制分析等一系列研究领域。该系统由一个大型 BiT（LgBiT；17.6 kDa）和一个小型 BiT（SmBiT；11 个氨基酸）亚基组成，它们将与目标蛋白质融合。这些亚基随后在细胞中表达，因此只有靶向 PPI 才能使这些亚基形成功能酶，从而产生明亮的发光信号（图 1）。 图 1. NanoBiT 蛋白质相互作用系统概览（图像 Promega 提供） 1.NanoBiT 的细胞内定位成像为进行细胞溶质和核酸表达，我们将两种载体对转染到 HeLa 细胞中。第一对为非靶向 FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体。第二对为细胞核靶向 NLS-FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体（图 2）。已知 FKBP 和 FRB 会在西罗莫司治疗下结合。 图 2. FKBP/FRB NanoBiT 和 NLS-FKBP/RRB NanoBiT 的细胞内定位 然后使用 IXplore Live for Luminescence 显微镜系统

1. 超级色差校正物镜PLAPON60XOSC 在脑组织四重免疫荧光中的应用在利用光学显微镜（如共聚焦显微镜）获取荧光图像之前使用荧光染料标记分子的方法，已成为可视化生物组织和细胞分子定位的最常用实验方法。然而，由于物镜的色差导致难以使用荧光染料精准显示紫外光和近红外区域中的细胞间共定位，因此在单个标本中很难获得多个细胞间共定位的准确数据。奥伟登（Evident）超级色差校正物镜 PLAPON60XOSC 即使在紫外和近红外区域也能以几乎没有色差的方式准确显示荧光标记分子。下面介绍使用四种类型的荧光抗体在单个标本中准确展示荧光标记分子的共定位情况。 PLAPON60XOSC 和 UPLSAPO60XO 的性能比较 2.超级色差校正物镜的应用-脑组织的四重免疫荧光 图 1. 脑组织的四重免疫荧光。VIAAT 染色（Alexa Fluor405，蓝色）；CB1 染色（Alexa Fluor488，绿色）；VGluT3 染色（Cy3，红色）；DGLα染色（Alexa Fluor647，白色）。 大麻素合成酶 DGLα（白色）和大麻素受体 CB1（绿色）聚集在小鼠基底杏仁核的锥体细胞躯体（星