研究应用｜使用共聚焦显微镜观察狨猴大脑皮层和丘脑之间神经结构

人类的前额叶皮层 (PFC) 不成比例地扩大，负责高级认知和执行机能。它的运转失灵可能导致精神疾病，如精神分裂症和阿尔茨海默病。人们对小鼠 PFC 进行了积极研究，但它缺乏与颗粒状额叶皮层相对应的区域，这表明它与灵长类动物存在巨大的结构性差异。因此，我们的研究小组正在使用狨猴这种原产于南美洲的小型猴子作为灵长动物模型。

在这项实验中，我们研究了 PFC 与丘脑网状核 (TRN) 之间的相互作用，后者是丘脑周围的一组抑制性神经元。TRN 就像一扇门，控制着从大脑皮层向丘脑的信息传输。我们研究了 TRN 中轴突纤维的详细形态，它们将信号从 PFC 传递到丘脑。

图 1. 显示神经轴突如何从前额皮质通过丘脑网状核进入丘脑的示意图。丘脑网状核起着通往丘脑大门的作用。

1. 采用简单工作流程的宏观到微观成像

起源于 PFC 的轴突纤维以厚束形式穿过一个叫作内囊的通道。这个轴突束穿过 TRN 的前部进入丘脑，在那里通过分裂和重新定向呈现出复杂的形态。为了准确识别 TRN，我们使用了 PV（小白蛋白）作为标记物（图 1）。

FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜的宏观到微观功能可无缝连接宏观和微观视图以实现共焦成像。我们利用此功能获得了 PFC 轴突纤维穿过 PV 阳性细胞的低放大倍率全景，然后切换到高放大倍率来观察细微轴突纤维和蕾状神经末梢的分支。

为了进行高放大倍率的观察，使用了硅油浸泡物镜在高分辨率下对样品深部区域进行了详细的观察。在低放大倍率下，我们只能观察到粗轴突纤维穿过 TRN。使用 40 倍硅油浸泡物镜时，我们可以观察到穿过 TRN 的纤维出现细微分支，并伴有无数蕾状颗粒结构（图 2）。

图 2. 使用宏观到微观功能绘制轴突纤维在从狨猴大脑的 PFC 到丘脑的途中与 TRN 相遇的位置。由于 TRN 神经元由 PV 阳性抑制性神经元组成，因此可以通过 PV 抗体（红色）加以识别。绿色代表来自大脑皮层的轴突末梢，青色代表细胞核。

成像条件

显微镜：FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜（奥伟登（Evident）现已推出全新 FV4000 共聚焦显微镜）

激光：405 nm（DAPI，青色）、488 nm（绿色荧光蛋白，绿色）、561 nm（小白蛋白，红色）

a. 物镜：PLAPON1.25X，拼接方式：3 × 3，比例尺：3000 μm

b. 物镜：UPLXAPO10X，拼接方式：2 × 2，比例尺：300 μm

c. 物镜：UPLSAPO40XS，拼接方式：2 × 2，73 切片，比例尺：30 μm（仅显示绿色和红色）

2. 轴突纤维微细结构的高分辨率三维观察

使用 100 倍硅油浸泡物镜拍摄了 Z 堆栈图像以进行三维重建（图 3）。我们得以观察到包围 TRN 神经元的蕾状颗粒的详细三维结构。

图 3. 从狨猴 PFC 前往丘脑途中的 TRN 内轴突纤维的高放大倍率 3D 观察

成像条件

显微镜：FLUOVIEW FV3000 共聚焦激光扫描显微镜（奥伟登（Evident）现已推出全新 FV4000 共聚焦显微镜）

激光：488 nm（绿色荧光蛋白，绿色）、561 nm（小白蛋白，红色）

物镜：UPLSAPO100XS