组织解离的常见问题及答案

1. 解离前取样、运输、储存注意事项

组织解离成功与否很大程度上取决于样本质量。不同的来源、取样方式、运输和储存条件可能会得到有明显差异的解离效果。一般建议取新鲜组织样本，取样过程尽量快速操作，避开坏死区域，低温保存在适宜的溶液中或短暂时间内进行解离实验，以保证足够好的细胞状态。

 

对于一些重要组织，当不能取样后立即进行下游解离时，需要将组织暂时储存，避免细胞坏死和凋亡，并防止细胞激活和细胞多能性的变化，以保持细胞的正常生理功能状态。常见的方法是冻存组织样本，但是在解冻后常常会导致大量细胞死亡，并且运输难度大。对于这些考虑，组织保存液MACS组织保存液（130-100-008）可以使新鲜固体组织在2-8 ℃ 保存 48 小时并避免细胞激活和凋亡等背景效应。

 

2. Buffer配制对酶活的影响？

在组织解离过程中，缓冲液（Buffer）的配制对酶活性有着至关重要的影响。配制不当的缓冲液会显著降低酶活，导致解离效率低下、细胞损伤增加或解离失败。

常见影响酶活性的关键因素：pH值，离子种类与强度，渗透压，温度，其他添加剂等。

按照说明书需要精心配制buffer，确保其维持最佳的pH、离子环境、渗透压，并提供必要的辅因子和保护，是保证组织解离酶发挥最高活性、实现高效温和组织解离的关键基础。

 

3. 酶是否可以反复冻融？

不建议反复冻融。 反复冻融会显著降低酶的活性稳定性。建议如下：

（1）分装保存： 将酶溶液分装成小份量储存于-20°C或-80°C，每次使用取出一份，避免整管反复冻融。

（2）避免频繁温度波动： 对于储存于4°C的酶制剂，同样不建议频繁取出放置于室温环境后再放回冷藏。这种温度波动也会损害酶活性。

（3）分装冷藏： 对于需在4°C短期保存的酶，同样建议进行分装。使用时仅取出所需分装管，并在规定时间内使用完毕，避免整管长时间暴露于室温。

 

4. 机械解离法 vs 酶解法 vs 组合法？

解离方法各有优缺点，根据不同组织类型和需求选择合适的解离方式。

（1）机械解离法：通过剪切、研磨、吹打等物理力破坏细胞间连接，无需酶试剂无需孵育时间成本较低，但是容易造成细胞损伤（如碎片多活率低）和解离不完全（如致密组织），常用于快速解离脾脏等柔软组织。

（2）酶解法：利用蛋白酶（胶原酶、胰酶、木瓜蛋白酶等）降解细胞外基质，温和解离保护细胞膜完整性，但是易破坏表位，且需要挑选合适的酶、优化酶浓度和孵育时间，大部分组织都常用酶解法。

（3）组合法：即机械解离+酶解，使组织均匀充分地接触酶消化液，减少了强机械力和过长酶消化时间对细胞造成的伤害。有商品化的经过验证的解离试剂盒可以选择，搭配全自动组织解离仪，做到高效而稳定地组织解离。

 

5. 如何解离肿瘤组织？

由于肿瘤组织异质性高细胞类型多（肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞等）、细胞间连接紧密细胞外基质异常沉积、结构和微环境复杂、异常代谢等问题，肿瘤组织的解离较为困难。样本的选取需要合适，并且也要根据不同的肿瘤组织特性选择不同强度的解离方式。

（1）根据肿瘤组织的坚硬度和目的细胞不同，可以选择合适的解离方案。

（2）剔除坏死/出血区域（剪刀精细修剪），保留活性肿瘤组织。

（3）由于肿瘤组织比较坚硬，会产生较多碎片和死细胞，影响下游实验可以通过Ficoll或者去死或碎片去除试剂盒（Debris Removal Solution，130-109-398）优化肿瘤样本。

 

6. 如何得到肝实质细胞？

小鼠和大鼠的肝脏组织包含实质细胞和非实质细胞（Kupffer细胞、肝星状细胞、肝窦内皮细胞、胆管上皮细胞、免疫细胞等），由于肝脏组织细胞连接复杂，实质细胞体积大且脆弱，通常需要采用灌流的方式得到肝实质细胞。灌流能通过血管灌注使胶原酶直接作用于血窦网络，相比于普通机械剪切消化来说更能避免损伤从而更温和更有效地释放肝实质细胞，维持好的细胞状态以进行下游实验。简单来说灌流法是获取高纯度、高活性肝实质细胞的金标准方法。

但是手动灌流操作难度较大，整个过程比较复杂耗时，操作人员需要经过培训练习并积累长期经验。对于时间和人员问题，可以考虑自动化灌流，批次间结果稳定且不需要专门的技术训练，如肝脏灌流试剂盒（Liver Perfusion Kit, mouse and rat，130-128-030） 搭配gentleMACS Octo八通道带加热全自动组织解离器使用。

 

7. 如何得到心肌细胞？

小鼠心脏由多种类型细胞构成，包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞、免疫细胞、平滑肌细胞等。其中心肌细胞通过闰盘紧密连接，需要较强的酶解，但细胞膜脆弱，很容易在解离过程中破裂而造成细胞死亡。尤其是成年小鼠心肌细胞，体积大且不规则，更加大分离难度。

对于新生小鼠，闰盘未完全成熟，细胞连接没有十分紧密，可以使用常规解离方法，但可能出现得率低的情况；对于成年小鼠，闰盘致密需要较强酶解，而为了得到活率好的心肌细胞，通常采用灌流的方式，但操作起来难度偏大，需要学习并练习操作技术，人工时间成本较大。

为了减少人工操作困难和解决小鼠心脏解离效果不稳定的问题，有新生鼠心脏解离试剂盒（Neonatal Heart Dissociation Kit, mouse and rat，130-098-373）、小鼠心脏灌流试剂盒（Heart Perfusion Kit, mouse，130-134-266）可以使用。

 

8. 罕见组织样本解离建议？

（1）对于罕见组织（如临床活检样本、胚胎组织、罕见病变组织等），这类稀有，微量，难获得的组织解离，在解离方案没有优化出来的情况下，建议选择类似的模式生物样本进行解离方案的优化，而不是直接用珍贵的罕见组织进行试验。

（2）可以选择通用型组织解离试剂盒，通过机械分离与酶消化相结合的方式，将组织分解成单细胞悬液，这种处理方式能够保持组织的结构完整性。其操作温和、快速且效果显著，能够解离后保持细胞活性。

（3）针对小鼠前列腺，小鼠耳部，发炎神经组织，大鼠肺部，成年小鼠/大鼠心脏等组织，结合通用的组织解离试剂盒，使用优化后的解离方案。

 

9. 解离后单细胞悬液质量的优化

单细胞悬液质量是下游实验成功的决定性因素。 单细胞悬液质量不佳会显著影响磁分选、单细胞测序、流式细胞术及类器官移植等关键实验。针对不同质量问题，需采取针对性优化策略：

（1）死细胞会和磁珠或者荧光染料非特异性结合，且死细胞会产生自发影响，影响流式分析，可以使用死细胞去死试剂盒Dead Cell Removel Kit Dead Cell Removal Kit（130-090-101）去除死细胞。

（2）细胞团块会粘连单细胞，且细胞团块较大，对下游单细胞测序和流式分析产生影响，可以通过使用不同尺寸的滤器，去除细胞结团。

（3）髓鞘是一种特殊的膜，它包裹并保护着周围神经系统和中枢神经系统的神经轴突。在幼鼠的脑组织样本解离过程中会产生大量的髓鞘碎片，影响下游分选或者分析实验，针对这种情况，可以使用专门研发的髓鞘去除试剂盒（Myelin Isolation Beads human, mouse, rat（130-096-433）从单细胞悬液中去除髓鞘碎片。

（4）关于是否需要红细胞裂解，一般组织不建议裂红，除非红细胞影响下游实验，因为裂红会影响细胞的活率和得率，尤其是一些敏感的细胞，比如说粒细胞，会因裂红造成敏感细胞的死亡，影响得率，同时产生的大量的红细胞的碎片也可能会影响下游实验，比如说磁分选/单细胞测序等。如果细胞悬液中红细胞的占比很高且严重影响下游实验，可以通过Ficoll密度梯度离心/去红细胞试剂盒Red Blood Cell Lysis Solution (10×）（130-094-183）去除红细胞。

1.  为什么组织解离后检测不到目标细胞？

需要判断是解离后的组织悬液中没有目标细胞还是没能检测到目标细胞，可以考虑以下几个方面：

（1）选取的样本中没有或只有极少目标细胞，需要更换合适的组织样本或增加起始组织量。

（2）解离方法不当，目标细胞死亡或没有被充分解离出来，需要根据目标细胞群挑选合适的方法。

（3）组织解离后的细胞悬液中目标细胞占比太少，低于常规流式分析检测下限，需要先做预富集。

（4）marker表位可能在解离过程中被酶破坏导致抗体无法结合，不同的marker对不同的酶敏感性不同，需要选择合适的消化酶或培养一段时间恢复表位后再做检测。

（5）细胞悬液中死细胞和碎片过多影响流式分析准确度，目标细胞较少时可能出现假阴性情况。

（6）选择的目标细胞marker表达较少较弱，如果搭配弱荧光（如FITC）偶联抗体可能难以检测到阳性信号，可以搭配强荧光（如PE、APC）或更换合适的检测marker。

（7）由于酶解或机械剪切力等细胞应激刺激而下调了某些marker，需要更换解离方式或检测marker，也可以添加通路抑制剂或静置使恢复表达。

 

11. 解离后的细胞悬液怎么评估质量？

组织解离后的细胞悬液质量是确保下游实验（如单细胞测序、细胞培养、分离纯化、功能试验）成功进行的关键因素。可以通过得率、细胞活性、目标细胞纯度和细胞功能等方面评估质量。例如血球计数板或自动细胞计数仪可以对细胞悬液进行简单计数（加入台盼蓝观察死活）；流式细胞术可以检测细胞数量、细胞活率、碎片占比、特定细胞marker、线粒体膜电位等；分析RIN值评估细胞RNA完整性等。

 

12. 为什么组织解离后细胞活率低？

（1）起始组织样本质量不好，如样本是否新鲜、是否含有坏死或纤维化部分。

（2）解离方法不合适，如机械力过强、酶消化过度、温度控制不当。

（3）组织解离时间过长。

（4）一些组织解离难度较大，解离后容易出现活率低的情况，如脑、心脏、脂肪、纤维化组织等。

 

13. 新鲜的血液样本来不及做下游实验怎么办？

加入抗凝血剂短期储存在4℃，不超过8 h，时间越长，样本质量越差，意味着细胞得率和活率会受到影响，不建议长期4℃储存，可以制备成PBMC长期冻存。

 

14. PBMC样本制备技巧

（1）血液样本中细胞密度较大，建议2-4倍稀释血液样本后进行离心。

（2）白膜分层不明显，建议检查离心机的状态，保持4°C离心，离心机关闭全刹车。

（3）在温度较高的情况下，Ficoll的密度较低，因此某些淋巴细胞可穿透Ficoll层，细胞的活性也会同时受到影响。在低温条件下，Ficoll的密度较高，因而红细胞的聚集效果比较差，红细胞和粒细胞不能很好地穿透Ficoll层而造成结果污染。所以Ficoll需要放置到室温再使用。

（4）离心机不稳定，导致密度梯度的波动，离心速度不够或离心时间过短：可能带来单个核细胞层的条带变宽，白膜分层不明显，导致PBMC中有较多的红细胞和粒细胞的污染。建议检查离心机是否配平合适，并检查离心机状态。

（5）当使用Ficoll处理经过冷冻/解冻处理后的陈旧血浆样本时，转速需要提高至1100×g 。

（6）Ficoll主要用于人外周血中淋巴细胞的分离，如果待分离的淋巴细胞来自其他的组织/种属，可能无法获得淋巴细胞的最佳产量和纯度，需要对标准操作进行优化。