研究应用｜使用 NanoBiT 技术进行的蛋白质相互作用细胞内定位成像

NanoBiT 是一种结构互补报告分子系统，可用于 PPI 的细胞内检测。它已成功应用于药物筛选、信号传导分析和病毒感染机制分析等一系列研究领域。该系统由一个大型 BiT（LgBiT；17.6 kDa）和一个小型 BiT（SmBiT；11 个氨基酸）亚基组成，它们将与目标蛋白质融合。这些亚基随后在细胞中表达，因此只有靶向 PPI 才能使这些亚基形成功能酶，从而产生明亮的发光信号（图 1）。

图 1. NanoBiT 蛋白质相互作用系统概览（图像 Promega 提供）

1. NanoBiT 的细胞内定位成像

为进行细胞溶质和核酸表达，我们将两种载体对转染到 HeLa 细胞中。第一对为非靶向 FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体。第二对为细胞核靶向 NLS-FKBP-SmBiT 控制载体和 FRB-LgBiT 控制载体（图 2）。已知 FKBP 和 FRB 会在西罗莫司治疗下结合。

图 2. FKBP/FRB NanoBiT 和 NLS-FKBP/RRB NanoBiT 的细胞内定位

然后使用 IXplore Live for Luminescence 显微镜系统对表达 NanoBiT 的 HeLa 细胞的生物发光进行了成像。为了确认细胞核的定位，用 Hoechst33342 对 HeLa 细胞进行了复染，并在同一显微镜上用荧光进行了成像（图 3）。

我们在接收待扩散到整个细胞液中的非靶向 FKBP/FRB NanoBiT 的 HeLa 细胞中观察到了生物发光信号。但由于 NLS-FKBP/FRB NanoBiT 与 Hoechst33342 荧光染色重叠，其生物发光被证实局限于细胞核。

图 3. FKBP/FRB NanoBiT 和 NLS-FKBP/RRB NanoBiT 的细胞内定位

实验条件：

显微镜：IXplore Live for Luminescence 显微镜系统

相机：imagEM EM-CCD 相机 (Hamamatsu Photonics)

物镜：LUCPLFLN60XPH

成像透镜：0.35X

EM 增益：1200

呋喃嗪浓度：1/200 稀释

西罗莫司最终浓度：30 nM

曝光时间：相衬 50 ms/生物发光 3 min/荧光 100 ms

图 4 显示了西罗莫司刺激前后的 NLS-FKBP/FRB NanoBiT 生物发光变化情况。西罗莫司刺激后细胞核内的生物发光强度增加。这些结果表明，在西罗莫司治疗下，FKBP 和 FRB 在细胞核内结合，这种相互作用引起了 NanoLuc 的生物发光。显微成像使我们能够观察到活细胞内细胞溶质和核酸生物发光强度变化，从而检测到西罗莫司刺激引起的 FKBP 和 FRB 的相互作用。

图 4. 西罗莫司刺激引起的 NLS-FKBP/FRB 生物发光强度变化

实验条件：

载体：NLS-FKBP-SmBiT/FRB-LgBit 载体（各 50 ng）

显微镜：IXplore Live for Luminescence 显微镜系统

相机：imagEM EM-CCD 相机 (Hamamatsu Photonics)

EM 增益：1200

物镜：UPLFLN40XPH

成像透镜：0.35X

曝光时间：相衬 50 ms/生物发光 30 s/荧光 100 ms

延时间隔：40 s

图 5. 奥伟登（Evident）IXplore Live for Luminescence 显微镜系统

2. 使用光度计和发光显微镜检查进行 PPI 探测

NanoBiT 和 HiBiT 技术使我们能够使用光度计探测高通量 PPI，而这些技术的显微成像使我们能够可视化这些 PPI 的细胞内定位。

将光度计与专用发光显微镜结合起来用于 PPI 探测具有若干优点。观察局部发生的 PPI 或其细胞内定位变化时，我们可以先使用显微成像来确认定位的准确性，然后再使用光度计进行高通量测量。该系统无需额外的荧光成像便可确认细胞内定位。我们可以使用表达 NanoBiT 或 HiBiT 的同一构建细胞系来检查细胞内定位和高通量光度计探测。