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- 2026年01月20日
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上海达为科生物科技有限公司
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软琼脂克隆实验
| 品牌 | 其他品牌 | 产地类别 | 国产 |
|---|---|---|---|
| 应用领域 | 医疗卫生,生物产业,综合 |
软琼脂克隆实验 某些恶性肿瘤细胞，不仅在贴壁状态下能增殖，在悬浮状态下也能增殖，其在软琼脂中形成克隆能力反映其恶性增殖程度，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤治疗检验等方面。
软琼脂克隆实验 原理:
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数，但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆。而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
由于细胞生物学性状不同，细胞克隆形成率差别也很大，一般初代培养细胞克隆形成率弱 ，传代细胞系强;二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强;正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。并且克隆形成率与接种密度有一定关系， 做克隆形成率测定时 ，接种细胞定要分散成单细胞暴液,直接接种在碟皿中，持续一周,随时检查，到细胞形成克隆时终止培养。
软琼脂克隆实验 基本步骤:
(1)取对数生长期细胞，用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含20%胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1x106细胞/L。然后根据实验要求作梯度信数稀释。
(2)用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低溶点琼脂糖液,高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。
(3)按1:1比例使1.2%的琼脂糖和2xDMEM培养基(含有2x抗生素和20%的小牛血清)混合后,取3mL混台液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7-10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。
(4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2 xDMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37C 5%CO2温箱中培养10-14天。
(5)把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数。计算形成率。
软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不直超过40°C。接种细胞的密度 每平方厘来不超过35个，一股6cm的平皿接种1000个细胞。正常细胞在悬浮状态下不能增殖，不适用于软琼脂克隆形成试验。
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文献和实验:(各位大侠： 小弟最近做克隆实验遇到很大的障碍，已经连续三次失败了。请各位大哥帮助分析原因，小弟不胜感激！ 我克隆的是一个肿瘤标志物的基因片段，长约150bp 。具体过程如下： 一， 普通PCR，电泳，切下特异条带； 二， 用QiaGene公司胶回收试剂盒提取特异条带DNA，所得胶回收产物约30ul。取2ul做荧光定量PCR(该方法条件优化已完成)，证实胶回收产物中目的片段含量很高。 三， 用上海生工的PUCm-T载体试剂盒完成连接反应。按说明书操作，反应过夜。 四，
谁是精子的供体。为法医鉴定提供一种新的有效方法。 参考文献 1．Drake JW, et al.Updating the theory of mutation. American Scientist, 1983; 71:621 2.Jukes TH, et al. Evolutionary nucleotide replacements in DNA.Nature, 1979;281:605 3.赵寿元.自然科学年鉴.上海翻译出版公司，1987 4．
, Courtovis Y, et al. Multiple deletions in mitochomdrial DNA are present in senescent mouse brain. Biochem Biophy Res Commum, 1994，202(2): 654-659 [４9] 萨姆布鲁克 J, 弗里奇 EF, 曼尼阿蒂斯 T. 分子克隆实验指南. 2版. 北京: 科学出版社, 1992 [５0] Ringel MD. Molecular diagnostic tests
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