细胞原位杂交实验

一、样本处理

1. 脱蜡与复水

   • 石蜡切片依次用二甲苯脱蜡（2×15min），无水乙醇梯度（100%-30%）复水，最后用DEPC水清洗。
   • 冰冻切片需用PBS洗涤后，进行梯度乙醇脱水（70%-100%）。

2. 抗原修复与去膜

   • 使用蛋白酶K（1μg/ml）37℃孵育30-40min，增强组织渗透性。
   • 甘氨酸溶液（2mg/ml）终止蛋白酶活性。

3. 变性处理

   • 78℃预冷的变性液（如含盐酸或乙酸酐的溶液）处理，破坏DNA/RNA双链结构。

二、探针制备与检测

1. 探针标记

   • 使用地gao辛（DIG）、生物素或荧光素标记探针，通过随机引物法或PCR法合成。
   • 探针浓度通常为0.5-5μg/ml，需通过梯度稀释检测敏感性。

2. 探针变性

   • 双链探针75℃水浴5min后冰浴，单链探针需预退火。

三、杂交反应

1. 预杂交

   • 预杂交液含甲酰胺（50%）、硫酸葡聚糖（50%）、BSA及载体核酸，42℃孵育30min-2h。

2. 杂交

   • 将探针稀释至400-1000ng/ml，滴加至样本，42℃杂交16-20h（DNA探针）或过夜（RNA探针）。

3. 杂交后清洗

   • 依次用SSC缓冲液（4×→0.2×）梯度清洗，温度从37℃升至57℃，去除非特异性结合。

四、抗体反应与显色

1. 封闭与抗体孵育

   • 3%BSA封闭非特异性位点，滴加抗-DIG-HRP抗体（1:5000稀释），4℃过夜。

2. 显色与复染

   • DAB显色液（含HRP底物）避光反应10-30min，苏mu精复染细胞核。
   • 荧光标记探针直接使用PI/DAPI染色，无需抗体步骤。

五、封片与观察

• 乙醇梯度脱水后，中性树胶封片，镜检观察信号定位。