克隆高手拉小弟一把

:(各位大侠：
小弟最近做克隆实验遇到很大的障碍，已经连续三次失败了。请各位大哥帮助分析原因，小弟不胜感激！
我克隆的是一个肿瘤标志物的基因片段，长约150bp 。具体过程如下：
一，  普通PCR，电泳，切下特异条带；
二，  用QiaGene公司胶回收试剂盒提取特异条带DNA，所得胶回收产物约30ul。取2ul做荧光定量PCR(该方法条件优化已完成)，证实胶回收产物中目的片段含量很高。
三，  用上海生工的PUCm-T载体试剂盒完成连接反应。按说明书操作，反应过夜。
四，  感受态细胞的制备：
1，  把DH5菌种分别接种在含氨卞的LB平板和不含氨卞的LB平板上，培养16-18小时。结果在不含氨卞的LB平板上DH5菌长出单个菌落，而在含氨卞的LB平板上无可见菌落生成，证明DH5菌未被杂菌污染；
2，  挑取单个菌落接种于2ml不含氨卞的LB肉汤，37度，150rpm,，振荡培养过夜；
3，  取上述0.2ml菌液接种于30ml不含氨卞的LB肉汤，37度，150rpm,，振荡培养3小时，使其OD600=0.4;
4，  将上述培养物转入40ml离心管，冰浴10分钟；
5，  低温离心机4，2500rpm离心10分钟，弃上清；
6，  用25ml 0.1M CaCl2溶液重悬，冰浴20分钟；
7，  低温离心机4，2500rpm离心10分钟，弃上清；
8，  用800ul 0.1M CaCl2溶液重悬沉淀，冰浴30分钟；
五，  转化反应：
1，  每管连接反应产物（10ul）加入感受态细胞100ul, 冰浴30分钟；
2，  热休克：42度，90秒；
3，  马上冰浴5分钟；
4，  各管分别加入0.8ml 不含氨卞的LB肉汤, 37度，100rpm,，振荡培养1小时;
5，  各管培养物用低温离心机4，2500rpm离心10分钟，留取上清约200ul，混匀，分别在含氨卞的LB平板（已涂布X-Gal和IPTG）上涂布均匀；
6，  37度培养过夜（16-18小时）；
六，  蓝白斑筛选：
1，  挑取白色，奶油样单个菌落7到8个，分别接种于3ml含氨卞的LB肉汤, 37度，150rpm,，振荡培养过夜；
2, 每管培养物取1.5ml,用上海生工的“小量质粒DNA抽提试剂盒”提取质粒DNA;
3, 取2ul质粒DNA做荧光定量PCR，证实产物中目的片段含量很低。

各位大哥，如能指出我上述操作中的不当之处，无疑是雪中送炭。小弟先向您致谢了！