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细胞迁移/细胞侵袭/细胞功能学

细胞迁移/细胞侵袭/细胞功能学
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和元生物技术(上海)股份有限公司
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地区: 上海
简介: 在A549细胞中过表达human Oct-4基因,通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定,研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。
提供商: oobio
服务名称: 细胞迁移/细胞侵袭/侵袭小室实验/transwell实验/细胞功能检测/细胞迁移与侵袭/细胞实验

细胞迁移/细胞侵袭/侵袭小室实验/transwell实验/细胞功能检测/细胞迁移与侵袭/细胞实验

 

摘要:在A549细胞中过表达human Oct-4基因,通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定,研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。

 

关键词:Oct-4,Transwell, A549,细胞迁移

 

一、实验原理

Transwell小室底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将其放置于孔板中,小室内称上室,培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

肿瘤迁移实验:研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

肿瘤侵袭实验:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

二、 实验目的

用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析,考察基因Oct-4对A549细胞的迁移能力产生的影响。

三、 实验步骤

实验共分以下4个主要步骤:

1.质粒转染细胞:

准备A549细胞,转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(8μg质粒,20μl lipofectamine 2000转染试剂) 。

2.Transwell铺板;

a) 转染12h后,胰酶消化,收集细胞: 细胞计数后,每个样品准备1×106 cells/mL。
b) 1,200rpm×5min 离心后,重悬浮于1mL无血清培养基。
c) 湿润小室: 将300μL预热的无血清培养基加入到小室中,常温放置1~2h,将ECM膜湿润
d) 将小室中的培养基去掉,24孔板中,没有小室的孔中加入500μL含10%血清的培养基
e) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中,尽量避免产生气泡
f) 每个样品取300μL,加入到小室中,即3×105 cells加入到小室中,37℃,5% CO2培养箱中培养
3. 细胞培养及染色;
a) 培养箱中培养72h后,取出小室
b) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉
c) 24孔板中,没有小室的孔中滴入15滴染色液(约500μL)
d) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中,尽量避免产生气泡
e) 常温放置20min,进行染色
f) 用去离子水洗3-5次,将背景洗掉
g) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果,用棉棒擦干

 

4.统计分析。
显微镜下拍照,使用Image-Pro Plus软件进行细胞计数。

 

四、实验结果

图1. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响

从左开始依次为A549空细胞组,NC对照组(过表达EGFP),实验组(过表达Oct-4-EGFP),每组实验均重复3次

 图2. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析

**表示p<0.01
结论:从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现,A549细胞在过表达Oct-4-GFP 72h以后,迁移能力均高于空细胞组以及对照组(p<0.01)。

 

五、 参考文献
1. Koch KR, Zhang CO, Kaczmarek P, Barchi J Jr, Guo L, Shahjee HM, Keay S. The effect of a novel frizzled 8-related antiproliferative factor on in vitro carcinoma and melanoma cell proliferation and invasion. Invest New Drugs. 2012 Oct;30(5):1849-64.、
2. Carmona FJ, Villanueva A, Vidal A, Muñoz C, Puertas S, Penin RM, Gomà M, Lujambio A, Piulats JM, Mesía R, Sánchez-Céspedes M, Manós M, Condom E, Eccles SA, Esteller M. Epigenetic disruption of cadherin-11 in human cancer metastasis. J Pathol. 2012 Oct;228(2):230-40.
3. Huang W, Deng B, Wang RW, Tan QY, He Y, Jiang YG, Zhou JH. BCAR1 protein plays important roles in carcinogenesis and predicts poor prognosis in non-small-cell lung cancer. PLoS One. 2012;7(4):e36124.
4. Liu D, Huang Y, Zeng J, Chen B, Huang N, Guo N, Liu L, Xu H, Mo X, Li W. Down-regulation of JAK1 by RNA interference inhibits growth of the lung cancer cell line A549 and interferes with the PI3K/mTOR pathway. J Cancer Res Clin Oncol. 2011 Nov;137(11):1629-40.
5. Mao H, Zhang L, Yang Y, Sun J, Deng B, Feng J, Shao Q, Feng A, Song B, Qu X. RhoBTB2 (DBC2) functions as tumor suppressor via inhibiting proliferation, preventing colony formation and inducing apoptosis in breast cancer cells. Gene. 2011 Oct 15;486(1-2):74-80.
6. Koch KR, Zhang CO, Kaczmarek P, Barchi J Jr, Guo L, Shahjee HM, Keay S. The effect of a novel frizzled 8-related antiproliferative factor on in vitro carcinoma and melanoma cell proliferation and invasion. Invest New Drugs. 2012 Oct;30(5):1849-64.
7. Chang HL, Pieretti-Vanmarcke R, Nicolaou F, Li X, Wei X, MacLaughlin DT, Donahoe PK. Mullerian inhibiting substance inhibits invasion and migration of epithelial cancer cell lines. Gynecol Oncol. 2011 Jan;120(1):128-34
8. Abouantoun TJ, MacDonald TJ. Imatinib blocks migration and invasion of medulloblastoma cells by concurrently inhibiting activation of platelet-derived growth factor receptor and transactivation of epidermal growth factor receptor. Mol Cancer Ther. 2009 May;8(5):1137-47.
9. Mendis E, Kim MM, Rajapakse N, Kim SK. The inhibitory mechanism of a novel cationic glucosamine derivative against MMP-2 and MMP-9 expressions. Bioorg Med Chem Lett. 2009 May 15;19(10):2755-9.
10. Xie Z, Choong PF, Poon LF, Zhou J, Khng J, Jasinghe VJ, Palaniyandi S, Chen CS. Inhibition of CD44 expression in hepatocellular carcinoma cells enhances apoptosis, chemosensitivity, and reduces tumorigenesis and invasion. Cancer Chemother Pharmacol. 2008 Nov;62(6):949-57.
11. Park JS, Koh YS, Bang JY, Jeong YI, Lee JJ. Antitumor effect of all-trans retinoic acid-encapsulated nanoparticles of methoxy poly(ethylene glycol)-conjugated chitosan against CT-26 colon carcinoma in vitro. J Pharm Sci. 2008 Sep;97(9):4011-9.
12. Jiang HB, Xu M, Wang XP. Pancreatic stellate cells promote proliferation and invasiveness of human pancreatic cancer cells via galectin-3. World J Gastroenterol. 2008 Apr 7;14(13):2023-8.
13. Rajapakse N, Kim MM, Mendis E, Huang R, Kim SK. Carboxylated chitooligosaccharides (CCOS) inhibit MMP-9 expression in human fibrosarcoma cells via down-regulation of AP-1. Biochim Biophys Acta. 2006 Dec;1760(12):1780-8.
14. Laman H, Funes JM, Ye H, Henderson S, Galinanes-Garcia L, Hara E, Knowles P, McDonald N, Boshoff C. Transforming activity of Fbxo7 is mediated specifically through regulation of cyclin D/cdk6. EMBO J. 2005 Sep 7;24(17):3104-16.
15. Chen YJ, Shieh CJ, Tsai TH, Kuo CD, Ho LT, Liu TY, Liao HF. Inhibitory effect of norcantharidin, a derivative compound from blister beetles, on tumor invasion and metastasis in CT26 colorectal adenocarcinoma cells. Anticancer Drugs. 2005 Mar;16(3):293-9.
16. Liao HF, Chen YY, Liu JJ, Hsu ML, Shieh HJ, Liao HJ, Shieh CJ, Shiao MS, Chen YJ. Inhibitory effect of caffeic acid phenethyl ester on angiogenesis, tumor invasion, and metastasis. J Agric Food Chem. 2003 Dec 31;51(27):7907-12.
17. Pan Q, Bao LW, Merajver SD.Tetrathiomolybdate inhibits angiogenesis and metastasis through suppression of the NFkappaB signaling cascade. Mol Cancer Res. 2003 Aug;1(10):701-6.

 

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Transwell细胞培养小室(1).共培养体系:小于3.0um孔径条件下,细胞不会迁徙通过,因此,若研究不涉及细胞运动能力,不需要细胞穿过聚碳酸酯膜,则应选择3.0?m以下孔径。常用0.4、3.0?m。将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的影响。Transwell细胞培养小室(2).趋化性实验可用5.0、8.0、12.0?m膜,上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室,计数进入下室的细胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。上海子起生物科技有限公司联系人:杨先生400-811-9081电话:021-58387065传真:021-58357065手机:13681619662qq:2453006496www.ziqibio.com邮编:200123上海浦东区高青路4567弄1号楼303①细胞B对细胞A的趋化作用:将细胞A种于上室,细胞B种于下室,可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。②趋化因子对细胞的趋化作用:将细胞种于上室,下室加入某种趋化因子,可研究该趋化因子对细胞的趋化作用。Transwell细胞培养小室(3).肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0?m膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。Transwell细胞培养小室(4).肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0?m膜,原理与肿瘤细胞迁移实验类似。上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,但与肿瘤细胞迁移实验不同的是,聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶,用以模仿体内细胞外基质,细胞欲进入下室,先要分泌基质金属蛋白酶(MMPs)将基质胶降解,方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。Transwell细胞培养小室货号    产品名称    产地    描述及包装3421    Transwell板( 24孔,孔径5.0um)    Corning    滤膜直径:6.5mm;滤膜孔径:5.0μm。48个/箱,12个/板,4块板/箱3422    Transwell板( 24孔,孔径8.0um)    Corning    滤膜直径:6.5mm;滤膜孔径:8.0ziqibio3422
检测肿瘤细胞迁移与侵润实验---TRANSWELL肿瘤迁移与侵袭实验Transwell小室底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将其放置于24孔板或6孔板中,小室内称上室,培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等方面的影响。1. 肿瘤迁移实验:研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。2. 肿瘤侵袭实验:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。上海生博提供:根据客户要求对相应肿瘤细胞类型进行Transwell肿瘤迁移及侵袭实验。 服务流程图
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