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细胞迁移/细胞侵袭/细胞功能学

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细胞迁移/细胞侵袭/细胞功能学
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  • 在A549细胞中过表达human Oct-4基因,通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定,研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。
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    服务名称: 细胞迁移/细胞侵袭/侵袭小室实验/transwell实验/细胞功能检测/细胞迁移与侵袭/细胞实验

    细胞迁移/细胞侵袭/侵袭小室实验/transwell实验/细胞功能检测/细胞迁移与侵袭/细胞实验

     

    摘要:在A549细胞中过表达human Oct-4基因,通过对Oct-4过表达细胞组、空细胞组与阴性对照组进入下室的细胞数量进行测定,研究Oct-4基因对细胞迁移能力的影响。实验结果显示Oct-4基因可以促进A549细胞的迁移能力。为进一步深入研究Oct-4基因的功能提供实验数据。

     

    关键词:Oct-4,Transwell, A549,细胞迁移

     

    一、实验原理

    Transwell小室底层的一张有通透性的膜(一般为聚碳酸酯膜),将其放置于孔板中,小室内称上室,培养板内称下室。由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞。应用Transwell可研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

    肿瘤迁移实验:研究肿瘤细胞的迁移能力或特定情况下肿瘤细胞的迁移能力。常用8.0、12.0µm膜,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,肿瘤细胞会向营养成分高的下室跑,计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。

    肿瘤侵袭实验:研究肿瘤细胞的侵袭能力或特定情况下肿瘤细胞的侵袭能力。在聚碳酸酯膜上涂上一层基质胶,模仿细胞外基质,上室种肿瘤细胞,下室加入FBS或某些特定的趋化因子,细胞要把基质消化后才可以从上室迁移到下室,计数进入下室的细胞量测定细胞的侵袭能力。

    二、 实验目的

    用质粒Oct-4-EGFP转染后的A549细胞与正常细胞组、阴性对照组进行比较分析,考察基因Oct-4对A549细胞的迁移能力产生的影响。

    三、 实验步骤

    实验共分以下4个主要步骤:

    1.质粒转染细胞:

    准备A549细胞,转染前一天按照70-80%密度铺在6cm培养皿中。16h后,按照转染试剂说明书转染细胞(8μg质粒,20μl lipofectamine 2000转染试剂) 。

    2.Transwell铺板;

    a) 转染12h后,胰酶消化,收集细胞: 细胞计数后,每个样品准备1×106 cells/mL。
    b) 1,200rpm×5min 离心后,重悬浮于1mL无血清培养基。
    c) 湿润小室: 将300μL预热的无血清培养基加入到小室中,常温放置1~2h,将ECM膜湿润
    d) 将小室中的培养基去掉,24孔板中,没有小室的孔中加入500μL含10%血清的培养基
    e) 用镊子将小室轻轻放入预先加好培养基的孔中,尽量避免产生气泡
    f) 每个样品取300μL,加入到小室中,即3×105 cells加入到小室中,37℃,5% CO2培养箱中培养
    3. 细胞培养及染色;
    a) 培养箱中培养72h后,取出小室
    b) 用棉棒将小室内的细胞和培养基去掉
    c) 24孔板中,没有小室的孔中滴入15滴染色液(约500μL)
    d) 用镊子将小室轻轻放入预先加好染色液的孔中,尽量避免产生气泡
    e) 常温放置20min,进行染色
    f) 用去离子水洗3-5次,将背景洗掉
    g) 小室内边缘残留的细胞会影响实验结果,用棉棒擦干

     

    4.统计分析。
    显微镜下拍照,使用Image-Pro Plus软件进行细胞计数。

     

    四、实验结果

    图1. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力的影响

    从左开始依次为A549空细胞组,NC对照组(过表达EGFP),实验组(过表达Oct-4-EGFP),每组实验均重复3次

     图2. 过表达Oct-4对A549细胞迁移能力影响的统计分析

    **表示p<0.01
    结论:从实验结果以及进入小室的细胞的数量统计分析可以发现,A549细胞在过表达Oct-4-GFP 72h以后,迁移能力均高于空细胞组以及对照组(p<0.01)。

     

    五、 参考文献
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    2. Carmona FJ, Villanueva A, Vidal A, Muñoz C, Puertas S, Penin RM, Gomà M, Lujambio A, Piulats JM, Mesía R, Sánchez-Céspedes M, Manós M, Condom E, Eccles SA, Esteller M. Epigenetic disruption of cadherin-11 in human cancer metastasis. J Pathol. 2012 Oct;228(2):230-40.
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    4. Liu D, Huang Y, Zeng J, Chen B, Huang N, Guo N, Liu L, Xu H, Mo X, Li W. Down-regulation of JAK1 by RNA interference inhibits growth of the lung cancer cell line A549 and interferes with the PI3K/mTOR pathway. J Cancer Res Clin Oncol. 2011 Nov;137(11):1629-40.
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