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- 2026年01月06日
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上海达为科生物科技有限公司
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软琼脂克隆实验
一、实验原理与核心价值
软琼脂克隆实验（Soft Agar Colony Formation Assay）是一种评估细胞非锚定依赖性生长能力的关键技术，广泛应用于肿瘤生物学、药物筛选及干细胞研究。其核心原理基于：
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恶性转化特征：正常贴壁细胞依赖基质接触生长，而恶性转化细胞可在悬浮状态下增殖，形成独立克隆。
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三维环境模拟：软琼脂（0.3%-1.2%琼脂糖）提供半固态环境，抑制细胞贴壁，迫使转化细胞通过自分泌信号维持增殖，模拟体内转移灶微环境。
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定量分析指标：克隆形成率（Colony Formation Rate, CFR）反映细胞群体依赖性、增殖潜能及恶性程度，计算公式为：
CFR(%)=克隆数接种细胞数×100CFR(%)=接种细胞数克隆数×100
二、标准化实验流程（以6孔板为例）
1. 材料准备
- 细胞系：推荐使用HeLa、K562等肿瘤细胞系或基因编辑模型（如Bhas 42细胞系）。
- 培养基：含10%-20%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640/DMEM，需预温至37℃。
- 琼脂糖：低熔点琼脂糖（如Sigma A9414），配制成1.2%底层胶与0.7%上层胶（双胶体系）。
2. 操作步骤
| 步骤 | 关键参数 | 注意事项 |
|---|---|---|
| 1. 细胞悬液制备 | 取对数生长期细胞，胰酶消化后过筛（300目尼龙筛），调整密度至500-2,000个/孔 | 确保单细胞悬液（显微镜验证），残留细胞团会导致假阳性 |
| 2. 底层胶铺制 | 1.2%琼脂糖与2×培养基等体积混合（终浓度0.6%），每孔4 mL，室温凝固30 min | 琼脂糖溶液需高压灭菌（121℃, 15 min），维持42℃水浴防凝固 |
| 3. 上层胶铺制 | 0.7%琼脂糖与2×培养基混合，加入细胞悬液（终密度0.35%），每孔2 mL | 操作需迅速（<5 min），避免局部凝固；避免气泡干扰克隆分布 |
| 4. 培养与观察 | 37℃、5% CO₂培养14-21天，每周补加0.5 mL培养基防干燥 | 使用倒置显微镜定期观察（建议7天、14天、21天记录），避免频繁开盖导致污染 |
| 5. 克隆计数 | 肉眼或显微镜（40×）计数直径≥50 μm的细胞团，每克隆含≥50个细胞 | 使用克隆计数仪或ImageJ软件（阈值法）提高精度 |
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文献和实验7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用。 (4)按1:1比例让0.7%的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1.2%琼脂糖底层平皿中，逐形成双琼脂层。待上层琼脂凝固后，置入37℃ 5%CO2温箱中培养10～14天。 (5)把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。 软琼脂培养法常用检测肿瘤细胞和转化细胞系。试验中琼脂与细胞相混时，琼脂温度不宜超过40℃。接种细胞的密度每平方厘米不超过35
I.Macpherson等于1964年首创的培养法，这一培养法选择性地使已转化的细胞进行增殖，而抑制正常细胞的增殖。通常是将含有0.5％琼脂的培养基作为营养层铺在底部，然后再将含有细胞的少量软琼脂培养基（琼脂量约0.3％）倒在上面。正常细胞仍停留在接种时的状态，几乎不进行增殖，但已转化的细胞则以半浮游状态增殖，而形成菌落。形成菌落的能力和对动物的还原接种所产生的形成肿瘤的能力经常是非常平行的。还有的方法是用大约1.3％的甲基纤维素来代替细胞层的琼脂。由于用保持低温的大量培养液洗涤，甲基
软琼脂(soft agar)实验一般用来检测细胞的集落形成能力。现在这种方法越来越多的用于分离癌细胞，也可以用来确认癌细胞是否具有癌化特性，为进一步做肿瘤小鼠移植模型奠定理论基础。该方法看似简单，但如果细节掌握不好，往往导致实验失败或数据缺乏说服力。如果你曾经在这个实验上栽了跟头，请不妨在如下几个方面进行尝试： 1.要确保在整个实验过程中所使用的琼脂处于完全液体状态（>80℃），尤其是在做基底时，如果琼脂凝固过快会导致基底不均一； 2. 做琼脂基底是应避免产生小气泡，一旦有小气
