上海细胞增殖实验

一、常用方法分类及原理

方法	原理	检测指标	适用场景
CCK-8法	利用水溶性四唑盐（WST-8）被线粒体脱氢酶还原生成橙黄色甲瓒，颜色深度与活细胞数正相关	450nm吸光度（OD值）	高通量筛选，实时监测增殖动态
MTT法	四唑盐（MTT）被活细胞还原为紫色甲瓒结晶，溶解后检测吸光度	570nm吸光度（OD值）	常规细胞增殖检测（需终止实验）
BrdU/EdU法	胸腺嘧啶类似物（BrdU/EdU）掺入新合成DNA，通过抗体（BrdU）或点击化学反应（EdU）检测	荧光信号或显色反应	检测DNA合成，区分增殖细胞
细胞计数法	直接计数细胞数量（如台盼蓝染色区分活/死细胞）	细胞数/毫升	简单快速评估增殖，无需特殊设备
CFSE染色法	荧光染料CFSE随细胞分裂均匀分配至子代细胞，流式细胞术检测荧光衰减	荧光强度（流式分析）	追踪多代细胞分裂（动态监测）

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二、实验流程示例（以CCK-8法为例）

1. 实验准备

• 试剂配制：CCK-8溶液（避光保存）、细胞培养基（含10% FBS）、待测药物（梯度稀释）。
• 细胞接种：
  • 消化对数生长期细胞，调整密度（如5×10³~1×10⁴ cells/well，96孔板）。
  • 每孔加入100μL细胞悬液，边缘孔用PBS填充以减少蒸发干扰。
  • 预培养24小时（37℃, 5% CO₂）使细胞贴壁。

2. 药物处理与培养

• 更换含不同浓度药物的培养基（设空白对照孔：无细胞+培养基；阴性对照孔：细胞+无药物培养基）。
• 培养24-72小时（根据细胞增殖速度调整时间）。

3. CCK-8检测

• 每孔加入10μL CCK-8溶液（终浓度10%），避光孵育1-4小时（定期观察显色程度）。
• 酶标仪测定450nm吸光度（OD值）。

4. 数据分析

• 计算抑制率：

• 绘制剂量-效应曲线（如使用GraphPad Prism拟合IC₅₀值）。

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三、关键优化与问题解决

1. 细胞接种密度

   • 问题：密度过高导致接触抑制，密度过低显色信号弱。
   • 对策：预实验确定最佳接种量（使对照组OD值在0.8-1.5之间）。

2. 实验时间窗口

   • 问题：处理时间过短导致差异不显著，过长引起细胞死亡干扰。
   • 对策：根据细胞倍增时间选择处理时长（如快速增殖细胞选24-48小时）。

3. 边缘效应

   • 问题：96孔板边缘孔因蒸发导致体积变化，影响OD值。
   • 对策：使用带盖培养板，边缘孔填充PBS或弃用。

4. MTT法甲瓒溶解不彻底

   • 对策：加入DMSO或SDS溶解液后震荡10分钟，或延长溶解时间至4小时。

5. BrdU/EdU法背景干扰

   • 对策：DNA变性步骤（BrdU需HCl或酶处理）需严格控时；EdU点击化学反应避光操作。

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四、方法比较与选择建议

指标	CCK-8	MTT	EdU	CFSE
检测速度	快（无需溶解）	慢（需溶解）	中等（需染色）	慢（需流式）
细胞毒性	低（水溶性）	高（需终止实验）	低	低
灵敏度	高	中等	高	极高（单细胞）
成本	较高	低	中等	高
适用终点	动态监测	终点检测	DNA合成期检测	多代追踪