实验问答

21,992,778 科研人在看

科研学霸天团，48小时有问必答

全部

细胞

问mg2+浓度是如何影响PCR扩增效率的?

我是金博士

PCR要用到聚合酶，酶的反应需要镁离子催化。

2 回答2552 围观

问RT-PCR 没有产物是为什么？

我是金博士

可能原因：1）RNA被降解建议解决方法：在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA使用良好的无污染技术分离RNA；在将组织从动物体取出后立刻处理在100％甲酰胺中储存RNA；如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂或释放所有结合的RNase。而且，在≥0.8 mM DTT时加入RNase抑制剂，一定要存在DTT。2）RNA中包含逆转录抑制剂建议解决方法：通过乙醇

1 回答1099 围观

问RT-PCR出现非预期条带是怎么回事？

我是金博士

可能原因：1. 物和模板非特异性退火，建议解决方法：在第一链合成中使用GSP，而不是随机引物或oligo(dT)。试用允许高温cDNA合成的GSP。2. GSP设计较差，建议解决方法：遵循用于扩增引物设计的同样原则。3. RNA中沾染了基因组DNA，建议解决方法：使用扩增级DNaseⅠ处理RNA。使用没有逆转录的对照反应检测DNA污染。

1 回答1337 围观

问western blot 可以同时加两种以上的一抗吗？

tao0129

最好还是不要同时加两种一抗。因为如果结果里面有非特异信号的话，就说不清楚了。做Western在同一张膜上检测目的蛋白和内对照，也是先上目的蛋白的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片；漂洗以后，再上内对照的一抗、二抗，ECL显色、压片、洗片。

1 回答4591 围观

问蛋白电泳中途不给力了怎么办？

tao0129

1. 如果sample 先跑的动，后来就不动了，很可能就是缓冲液的问题，这时候单纯的提高电压是没用的。2. pharmacia 系统跑的时候可以清楚的看到电极丝上面有气泡形成，电压越高气泡越多。有气泡但是sample就是不动，那一定就是缓冲液问题。3. 检查缓冲液的时候，从配胶缓冲液开始查起，有些新同学在配胶的时候可能就是吧浓缩胶缓冲液和分离胶缓冲液弄混了。4. 另外，电泳缓冲液最好是用前现配，尤

1 回答2146 围观

问在 WB 实验中，使用 TBS 和 PBS 的区别？

赵栋2012

选择合适的缓冲液对于维持一定pH值下蛋白质的稳定及保证实验的重复性是很重要的。PBS的缓冲能力强于TBS（因为混合缓冲液在一定的离子强度下常常具有更宽的缓冲范围），TBS在pH7.0 以下缓冲能力较弱（不过PBS易污染）。但我们常常要根据我们实验目的选用合适的缓冲液，如在蛋白纯化中进行阴离子交换层析，阳离子缓冲液首选TBS；阳离子交换层析时，阴离子缓冲液则首选PBS。

1 回答10242 围观

问Western Blot 那种染色好？各有什么特点？

赵栋2012

zyffzw战友回答：1.阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5 μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。2.胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。3.生物素化灵敏度位于1~3之间

1 回答1782 围观

问引物间形成二聚体怎么办？

我是金博士

1、不能重新设计就试试降低一下引物浓度，调整一下体系如优化镁离子浓度或改变模板量。除此之外，形成引物二聚物的原因很多，如聚合酶是否活化，还有program，退火温度太高，时间太短，延伸时间太短都可能是原因。2、把循环中的退火温度提高，避免二聚体的形成。必要的时候，做两步PCR——退火和延伸都在70或72度进行。3、在设计引物时，在上下游引物的5'端加上序列一样的寡核苷酸尾巴，使得PCR进行到第三个

1 回答3355 围观

问PCR 实验中 dNTP 加过量会有什么影响？

我是金博士

dNTP可以与Mg2+结合，从而降低体系中Mg2+浓度，造成Taq的聚合活性下降。另一方面， dNTP过量，可以增大错误扩增的几率，导致出现非特异扩增产物和smear。

1 回答3597 围观

问Western Blot 中抗体反复冻融会影响结果吗？

赵栋2012

wandrer战友回答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。

1 回答4622 围观

问Western Blot 实验如何选膜？PVDF 膜还是 NC 膜？

tao0129

PVDF膜价格较贵，可重复使用，特别适合蛋白印迹，结合能力较强，但价格比较昂贵。 NC膜价格比较便宜，应用较广，结合牢固性差一些，韧性也不如PVDF，不能重复使用，但蛋白吸附容量高，亲水性较好。两者都可以用丽春红染色。具体使用还要参考相关文献。

1 回答1492 围观

问WB 实验跑胶条带怎么变成横竖交错了？

小坏2012

可能的原因：1、样品煮沸十分钟后，要离心（12000rpm；10分钟或者更长时间）2、上样的时候注意不要吸入底部的沉淀；如果是以前处理的样品，再次上样前，也要从新离心。3、上样量太大，可以减半或更少。4、电流过大，尤其是样品通过分离胶的时候，最好不要超过40 mA。<5、电泳缓冲液成分或者浓度有问题。6、配胶的液体有问题，尤其是tris盐酸可能性最大。7. 应该简少蛋白质的量：厚胶50~80

1 回答2163 围观

问出现片状拖带或涂抹带该怎么办？

hellokitty5

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。③适当降低Mg2+浓度。④增加模板量，减少循环次数

1 回答2308 围观

问蛋白的上样量有没有什么具体的要求？

赵栋2012

ptglab战友回答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过。

1 回答2305 围观

问培养基配置时候用到的纱布或报纸是否需要干燥处理？

我是金博士

干燥了放冰箱里也湿了吧？一般培养基不需要放进冰箱的，直接放在实验台，培养基灭菌后，从灭菌锅里拿出来，瓶口的纱布是湿的，需要风干。有些平板，倒好，凝固了，第二天马上要用的，可以用封口膜封上，放进冰箱。

1 回答1732 围观

问出现非特异性扩增带是何原因？

我是金博士

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或

1 回答4329 围观

问PCR 有条带，但是转化后再验证却出现假阳性？

我是金博士

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。　　引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。　　靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但

1 回答2347 围观

问WB 实验中为什么我的条带会跑得比正常的窄？

赵栋2012

drake015战友回答1. 可能因为胶凝的不均匀，聚合的不是很好，灌胶的时候尽量混匀。2. 是不是有窄有宽？可能与你拔梳子的时候有关，拔梳应该迅速，冲洗加样孔的时候要小心，以免把上样带扭曲；胶配好了用枪吹几下再灌胶，还有就是要等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。3. 可能是你样品的问题，如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一，由于同样的原因，样品在凝胶中的速度会很慢，造成条带

1 回答2771 围观

问WB 实验结果为什么出现了多条带？

tao0129

一抗、或二抗抗体浓度太高，多克隆抗体本身的非特异性反应，抗体的特异性不强，目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或认为的造成目的条带浓度的变化，所以严格意义上说，内参是必须做的。

1 回答5075 围观

问半干转是否要求膜，滤纸，胶同样大小？

tao0129

可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层虑纸也不能因过大而相互接触，这样同样会短路，电流不会通过胶和虑纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5~3倍都是正常的。一般Buffer和滤纸选的对就不会短路。

1 回答2432 围观

关于丁香通

公司信息

个人用户

企业机构

无忧采购轻松科研

提问

扫一扫

实验小助手

扫码领资料

反馈

TOP

打开小程序