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实验问答

27,517,058 科研人在看

问外周血单个核细胞（PBMC）

丁香实验

破骨细胞没诱导培养过，刚看了下资料，猜测你估计是用血液单核细胞诱导法诱导分化培养，这个就需要贴壁的单核细胞，单核细胞是半贴壁的细胞，可以只加培养液不加血清诱导因子于培养箱孵育1-2h，然后用PBS慢慢清洗去除不贴壁的淋巴细胞和其他杂细胞杂质等，这样六孔板下单核细胞纯度就高了，看了你这图片，铺板密度有点低啊，以前做过2-undefined10^6/ml铺孔PBMC分离单个核细胞，然后洗涤纯化，单核纯度很高。然后加

3 回答7655 围观

问大家来谈谈95D,95C的培养心得吧

丁香实验

谢谢评论，今天36h，细胞在10cm皿和六孔板里全死了。我估计消化确实有问题，但是不知道到底是消化过度还是消化不足。同时养的A549、293T贴壁也不好。12h了，贴壁后形态还是圆的，贴壁不稳当

3 回答1250 围观

问【求助】ChIP超声条件摸索

丁香实验

还有，一般超声片段范围在200_1000比较好，其实200_2000也是可以接受的，只要能保证70%以上在这个范围，就可以了！

2 回答1774 围观

问低丰度表达的蛋白做WB有什么好方法吗？

丁香实验

低丰度蛋白用WB检测的确会有些困难，但第二张我看到目的条带了，既然丰度低就意味着非特异性结合会提高，我建议你有两点：1，二抗浓度的把握要精准，在能呈现目的条带时降低二抗非特异性结合的概率2增加Tween-20的工作浓度，用更改过的工作浓度去配置TBST清洗，背景的效果可能会改善不少，自然而然目的条带也会展现出来了。

1 回答977 围观

问CHIP超声后DNA浓度上不去，求助大神

xue454962321

按照CST9005试剂盒描述是抽提了细胞核，之后Micrococcal Nuclease酶切是在保证细胞核完整的状态下做的，离心之后需要的是沉淀（细胞核），这个时候上清里面是没有东西的，因为细胞核还没有被破膜；之后再把细胞核沉淀裂解，用超声的方法帮助破核膜，在离心取上清。此时，蛋白和核酸都应该在上清里面。如果你提取的是Micrococcal Nuclease酶切之后的上清，那应该就是没有DNA的；

2 回答758 围观

问WB 点样孔有残留，跑出的条带就变形了，这是怎么回事呢

丁香实验

我老师说出现这种情况在水浴5-10分钟试试

1 回答509 围观

问ChIP中input的问题

bob523740605

我最后做的是Qpcr ，数据分析的时候是一input为基准的分析，通过一个excel表分析http://http://d.dxy.cn/detail/4076728

2 回答545 围观

问【原创】Western blot 之制胶技巧，易翻车点及其解决方法汇总

丁香实验

说到WB制胶，相信很多同志都有说不尽的"翻车"故事。俗话说的好，工欲善其事必先利其器，SDS PAGE凝胶就是我们做WB要利的器，因为高质量的胶是跑出漂亮条带的重要前提之一。今天我们就来探讨一下制胶这个事。一、SDS PAGE 凝胶制备1、玻璃板梳子的清洁先用自来水浸泡5分钟，洗洁精清洗，注意厚玻璃板两侧沟槽容易残留胶，可以用尖锐的东西轻刮，然后用自来水冲洗干净泡沫，再用纯水冲洗即可，37度烘干或

1 回答8606 围观

问wb 小白求助 E-cadherin 和 N-cadherin 转膜条件和分子量是多少？

丁香实验

E-cadherin是135，一抗的话我们是4℃。转膜的话，我们是恒流，300mA，90min左右

1 回答1344 围观

问染色体免疫共沉淀实验求助，那个proteinA/G是怎么回事？

丁香实验

别买磁珠需要相应的仪器来做磁珠肯定方便些的还有就是珠子不容易吸走背景好点噪音小不过细心点用普通的beads 离心也就可以了

2 回答696 围观

问【求助】PCR实验目的基因的CT值和内参的CT值接近

冰雪芙儿

CT值高，提高模板浓度就行了，我最近也在做，刚开始稀释发现CT值很高，不稀释就好了

2 回答1483 围观

问PCR 结果

午后的红太狼

感觉是因为你提出来的RNA量太少的缘故，从你的内参的CT值可以看出来，可能你要检测的基因本来表达量就不高，内参的CT值不够低的时候，你的目的条带就扩不出来了，大概的看了一下，目的基因有值的那几个，基本都是内参测得比较低的几个，所以建议RNA多提一点，多逆一点，把内参的CT值降到20以下就差不多了

1 回答2345 围观

问【求助】PCR 产物在加样孔里跑不出来怎么回事

xuyongbin

我也曾经遇到这种情况，后来把产物稀释100倍还有，最后我把产物稀释1000倍。取0.5ul，把退火在温度在原来基础上提高2℃就好了，可能是模板量太大的原因。

1 回答1628 围观

问PCR产物电泳条带

sakeiiii

会不会是模板有问题，RNA跑胶了吗？后面这个应该是二聚体或者非特异性扩增？也可能引物有问题

1 回答381 围观

问PCR的CQ值很大?

杨楠520

降低退火温度试试，我降了就可以了

1 回答307 围观

问PCR扩增不出DNA？

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

2 回答690 围观

问显色弱灵敏度低？

丁香实验

在完成所有实验步骤进行底物TMB溶液显色后，酶标板中孔的显色比较浅，即只有微弱的信号呈现。出现该现象的可能原因：产品过有效期，试剂没有按规定进行适当的保存。试剂，标准品或者样品在使用前没有平衡到室温。少加了试剂的量或者加入试剂的稀释比例不当。洗板或者加样过程中，酶标物受污染失活。孵育时间和孵育温度未达到实验要求。洗涤液稀释倍数不符合要求，洗板次数过多，洗板冲击力过大，洗板浸泡时间过长。底物溶液TM

1 回答531 围观

问冰冻切片和石蜡切片各自的优劣之处是什么？

丁香实验

1、从一抗的选择方面来看。有的一抗既能做石蜡切片又能做冰冻切片，而有的一抗只能做冰冻切片，关键取决于所要检测的抗原稳定性，有的抗原不稳定，经过组织固定，脱水、透明、浸蜡、包埋、脱蜡等一系列的做石蜡切片的步骤，所检测的抗原易被破坏，这时只能用冰冻切片来做，检测这类抗原的一抗只能做冰冻切片，而那些稳定的抗原，能经受住石蜡切片的的考验，一般来讲也可以用冰冻切片来做，总得来讲，对于既可以用冰冻切片也可以用

1 回答849 围观

问一抗孵育的条件和浓度如何摸索？

丁香实验

1、孵育条件选择：根据大量外文文献参考，4度过夜的最多，37度或直接室温的较少。故可以按照4度过夜+室温或37度复温（增进抗体抗原结合和防止脱片）。2、组织切片的选择：仅选择某一组同一只动物标本，这样才有可比性，且最好是预想肯定阳性的组别中的动物切片。3、一抗浓度摸索：主要参照说明书推荐的浓度，并结合文献中对于某种组织的大概浓度范围，同时也要考虑不同公司之间同一抗体的浓度和效价的不同。从最高浓度向

1 回答673 围观

问如何避免荧光素提前衰退？

丁香实验

1、从荧光标记的二抗孵育开始、二抗孵育后的清洗、保存均要进行避光；2、选择质量好的荧光素标记的二抗：亲和力强且衰退时间延长；3、用含有抗荧光萃灭的封片液来封片；4、拍照时尽量缩短激发光对切片的照射时间，最好在暗场环境；5、保存要用指甲油封固后4度避光保存。6、荧光素标记的二抗浓缩液一定要避光保存：没加石蜡，最后-70度以下低温保存；若加了石蜡油，则-20度保存即可。

1 回答608 围观

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