【求助】泛素化出不来！
superamare
临床本科，目前在导师实验室做泛素化实验，依照老板paper上的方法多次重复，但均没有出现预期条带，求大牛学长学姐帮助。
我用的Flag-X和HA-Ub磷酸钙共转293T，一般都是36小时收细胞，收细胞前8小时加MG132（5微M），裂解，加Flag-M2 beads，洗脱3小时，最后孵anti-HA，但是预期的拖尾条带根本没有出现过。
是泛素化实验有哪些需要注意的地方我没有做到么？满地打滚求帮忙！
2 个回答
卡戎3521
有帮助
反过来拉，用ha抗体做诱饵蛋白，fkag显色。。
我开始就是转myc/his-Ub质粒跟Flag-A蛋白的质粒，使用Flag做诱饵蛋白，但是每次都搞不出来。。后来看了很多文献，有的就是用Ni直接拉His这种方法，我用类似的His抗体做，成功率就还可以，目的蛋白的上方有多个条带，对照里面就没有~~
shylook
有帮助
1 单检测HA-UQ看看是否有表达
2 延长曝光时间 看UQ的ladder 过曝有时是必须的
3 你这个蛋白是否有泛素化？是公认的 还是预测的 还是质谱鉴定的
4 但是预期的拖尾条带根本没有出现过？这句话是什么意思 ？
是HA抗体没有条带？还是在目的蛋白10kd上方只有一个带？有时候 确实会有单泛素化的现象
或者按2来处理
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