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实验问答

31,504,055 科研人在看

问请问elisa实验中，空白、阳性对照、阴性对照均显色，可能是什么原因？

sfnana

您好，楼主，请问你的问题解决了吗？我现在也是出现了跟你一样的问题，阴性，空白值都很高。（我做的是双抗体夹心，biotin标记的抗体 1：1000 100uL/孔，亲和素1：5000）样本（O.D.450 nm）阴性（O.D.450 nm）空白（O.D.450 nm） 2.5310

6 回答2214 围观

问细胞免疫荧光探讨

旅途中的搬运工

我最近也在做，做了好几次甩片了，准备试试在流式管或者EP管里面固定加染色了，做完最后一步再甩片了。甩片完了在固定，细胞形态会改变，结构可能也完整

4 回答1761 围观

问流式细胞技术测定细胞内游离钙浓度为何要使用氯化钙？

LM0309w

1、流式细胞仪上的FL2-W FL2-A FL2-H 分别是做什么的？FL2-W是只检测荧光的脉冲宽度， FL2-H是指脉冲高度。通常在做细胞周期分析时应用，用于去除粘连细胞。2、流式同型对照怎样选择？同型对照（IsotypeControl）：使用与一抗相同种属来源、相同亚型、相同剂量和相同的免疫球蛋白及亚型的免疫球蛋白，用于消除由于抗体非特异性结合到细胞表面而产生的背景染色。如果一抗是多抗，可以

9 回答581 围观

问DNA、mRNA和蛋白质–这是一个悲伤的故事

7月未央

哭着哭着，蛋白就水解了。（= =|||||||||||||||||）DNA终于又转录了一个mRNA。DNA说：“你好，我是你的模板。”mRNA说：“你好，我是mRNA。”DNA仔细地看着mRNA：“你和他，真是一模一样。”mRNA：“谁？”DNA：“我上一次转录的mRNA。”停了停，又说：“你们明明是一样的，为什么我还在想念他呢？”说完，DNA慢慢合上了眼睛（…）。如果相遇的尽头注定是错过，是不是

2 回答1091 围观

问DNA琼脂糖凝胶电泳关于上样的问题

mpark

For DNA with size less than 150 bp, try to run native PAGE, DNA over 200 bp, try to run 2% agarose gel (60V for 30 minutes). If you want to run 4% agarose, try to use low melting temperature agarose i

4 回答2957 围观

问PCR扩增不出DNA

我的头痛不再痛

1、其实产物和marker比起来大小上有点偏差是很正常的，包括蛋白在内的分子标量，有时候不是那么准确，这个不必担心，只要差别不是很大就可以。完全可以通过测序去验证。2、之前能扩增出来，后来就扩增不出来，相同的扩增条件和体系，那是否就是模板的问题呢？比如你使用了新的模板，这样就有可能是你模板的质量或浓度问题。

2 回答1134 围观

问咨询一下关于质粒的问题

realtimes

OD测定没有电泳准，电泳可见即所得，OD有不一定有质粒

3 回答737 围观

问DNA的分子量估算

ajun333333

核酸、核苷酸的基本换算1．核酸的换算：(1)摩尔数与质量：1 μg 1,000bp DNA = 1.52 pmol1 μg pUC18/19 DNA (2,688bp) = 0.57 pmol1 μg pBR322 DNA (4,361bp) = 0.35 pmol1 μg SV40 DNA (5,243bp) = 0.29 pmol1 μg FX174 DNA (5,386bp) = 0.28

1 回答1302 围观

问培养液分泌蛋白质谱前处理

青木书生

非标，具体原理你可以去看看我之前的帖子。你这个实验，前期定量在这个实验里面非常重要，毕竟全蛋白如果TIC差距过大，normalization还有个内参蛋白参考。建议送样前跑胶定量。DTT，IAA的母液可以使用10mM-50mM的NH4HCO3溶液，也可以用水配母液。具体工作浓度varies a lot by studios,自查JPR或者MCP文章。IAA注意避光配置，避光孵育，不宜反应时间过长。

2 回答1157 围观

问【求助】泛素化出不来！

卡戎3521

反过来拉，用ha抗体做诱饵蛋白，fkag显色。。我开始就是转myc/his-Ub质粒跟Flag-A蛋白的质粒，使用Flag做诱饵蛋白，但是每次都搞不出来。。后来看了很多文献，有的就是用Ni直接拉His这种方法，我用类似的His抗体做，成功率就还可以，目的蛋白的上方有多个条带，对照里面就没有~~

2 回答3464 围观

问一个质谱结果想请教大家如何分析

黑糊糊2000

这结果应该是PD sequest search result。我们从来不用score。都是PSM vaule. 你的结果是IP 那应该和negative control 比。但是你要注意low psm 不代表这个就是 false positive. 因为这个ＰＳＭ和蛋白长度也相关所以低PSM 不见的就不好。IP 的结果一般你的bait 会有最高的PSM 有时候也会是heatshock 或者 ri

1 回答1123 围观

问求PCR结果怎么做出这样的散点图

seuzsl

先求每个样本的2的-Δct，然后所有结果除以对照的均值，就可以作图了

1 回答2313 围观

问qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

seuzsl

理论上讲不同样本内参Ct值的差异并不影响结果解释，因为对于同一个样本而言，目的基因ct-内参ct应该是一个常数，而在提取RNA时，取样量（即，细胞数）存在差异会导致得到的RNA总量有差异，即便通过细胞计数取了等量的细胞，提取时RNA的得率也不同，即便取了相同质量的RNA进行逆转录，不同样本间降解程度、其它rna表达水平都可能会导致内参ct存在差异（当然这种差异不应该很大），这就是为啥一定要做内参，

2 回答17571 围观

问如何进行QPCR中多组数据的统计分析？

香柏树001

相对表达量，我用的是2-△△CT法，每组3各平行要有的，然后得出的Ct值，计算出2-△△CT值就可以了，这样就得出3各2-△△CT，要比较的两组之间求P值就行了。附件讲的比较详细。

1 回答1231 围观

问为什么目的基因Ct值正常，反而内参的Ct值很高

杜小涛

引物反复冻融次数多了就有可能降解，不过你这个可以先考虑基因时空表达的问题，如果确定你做的这个时期和组织确定表达量并不低，就有可能是引物反复冻融导致的降解了

3 回答1372 围观

问外周血单个核细胞（PBMC）

丁香实验

破骨细胞没诱导培养过，刚看了下资料，猜测你估计是用血液单核细胞诱导法诱导分化培养，这个就需要贴壁的单核细胞，单核细胞是半贴壁的细胞，可以只加培养液不加血清诱导因子于培养箱孵育1-2h，然后用PBS慢慢清洗去除不贴壁的淋巴细胞和其他杂细胞杂质等，这样六孔板下单核细胞纯度就高了，看了你这图片，铺板密度有点低啊，以前做过2-4*10^6/ml铺孔PBMC分离单个核细胞，然后洗涤纯化，单核纯度很高。然后加

3 回答7959 围观

问大家来谈谈95D,95C的培养心得吧

丁香实验

谢谢评论，今天36h，细胞在10cm皿和六孔板里全死了。我估计消化确实有问题，但是不知道到底是消化过度还是消化不足。同时养的A549、293T贴壁也不好。12h了，贴壁后形态还是圆的，贴壁不稳当

3 回答1661 围观

问【求助】ChIP超声条件摸索

丁香实验

还有，一般超声片段范围在200_1000比较好，其实200_2000也是可以接受的，只要能保证70%以上在这个范围，就可以了！

2 回答1960 围观

问低丰度表达的蛋白做WB有什么好方法吗？

丁香实验

低丰度蛋白用WB检测的确会有些困难，但第二张我看到目的条带了，既然丰度低就意味着非特异性结合会提高，我建议你有两点：1，二抗浓度的把握要精准，在能呈现目的条带时降低二抗非特异性结合的概率2增加Tween-20的工作浓度，用更改过的工作浓度去配置TBST清洗，背景的效果可能会改善不少，自然而然目的条带也会展现出来了。

1 回答1113 围观

问CHIP超声后DNA浓度上不去，求助大神

xue454962321

按照CST9005试剂盒描述是抽提了细胞核，之后Micrococcal Nuclease酶切是在保证细胞核完整的状态下做的，离心之后需要的是沉淀（细胞核），这个时候上清里面是没有东西的，因为细胞核还没有被破膜；之后再把细胞核沉淀裂解，用超声的方法帮助破核膜，在离心取上清。此时，蛋白和核酸都应该在上清里面。如果你提取的是Micrococcal Nuclease酶切之后的上清，那应该就是没有DNA的；

2 回答952 围观

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