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问
先阳选磁珠分选CD4+T细胞后,下一步如何分选CD4+CD25-T细胞?
半两月光
最近刚做了一次,我用的是美天旎的kit,先阴选CD4阳性细胞,再标CD25抗体,阴选出来的就是CD25阴性细胞,纯度还挺高的,一定要用它推荐的柱子,否则纯度不高
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问
石蜡切片免疫荧光背景很脏什么原因?怎么办?
颜渊溪桥
建议先看下抗体是否适合做免疫荧光,另外可以染个DAPI聚下焦,操作过程除了洗和封闭外,抗原修复步骤需要改善,可以试下不用 H2O2阻断。
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问
ELISA的样品稀释2000倍,这么大的稀释倍数是否要导致结果不准确?
颜渊溪桥
建议按梯度倍数稀释样品,对照标准曲线,只要不超过标曲范围,检测结果是可信的。
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问
在ELISPOT结果中出现不规则的大块斑点,有的区域没有斑点是什么原因?
西柚味的芋圆
培养期间不要移动 plate,并且采取措施防止蒸发,可以使用铝箔纸包裹 plate。细胞去除不完全会破坏 spot 的形成。HRP 结合物(HRP-conjugates)不能在含有叠氮化钠的 buffer 中使用,因为叠氮化钠会抑制酶的活性。残留的底物会引起孔中的色斑。
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问
细胞增殖检测方法除了MTT,还有哪些?
半两月光
是不是Brdu掺入法,在DNA合成时Brdu代替胸腺嘧啶掺入到DNA中,通过抗Brdu抗体检测Brdu掺入量来反应细胞增殖情况
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问
过程中发现有的小鼠炸毛有的没有炸毛,不知道这是什么原因?
dxy_zutyknhe
可能是抗原毒性引起的,一般跟免疫效果是没有直接关系的,炸毛可能是小鼠身体不太好吧
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问
请问流式细胞术单抗直接荧光需要几种对照?
dxy_zutyknhe
先确定你用的直标抗体的荧光染料,然后确定该抗体的来源总属,选择相应的同型对照
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问
为什么做了两次免疫组化鉴定细胞都呈现的是黑色的?
dxy_zutyknhe
可能是没有进行固定和破膜,也要注意是不是贴片反了
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问
检测细胞中叶绿素的绝对值计算问题
西柚味的芋圆
感觉不太行,为啥不用液相色谱或者别的方法。一定要测的话,可以,用特定浓度的标准品用流式跑标准曲线进行检测
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问
多组实验下想根据OD值计算样本浓度,应该如何计算?
莹啊免疫啊
按每组的算,每组都可能会有不同阴阳对照的值,不能完全统一
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问
如何灭活内源的RNA酶,以防止RNA降解?
丁香实验
以下3个方法均可有效使内源RNA酶失活:(1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆。(2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令RNA酶失活(3)立即将样品置于RNAlater? Tissue Collection:RNA Stabilization Solution中。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未
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问
细胞胞质疏松,状态不好,养不起来怎么办?
丁香实验
——解决办法1:一般情况下,从血清下手就行,要么换好血清,要么提高血清浓度,血清浓度提高到 15%~20% 培养 48 h,换成正常 10% 的浓度,用高浓度的血清培养时间过长对细胞有毒性。——解决办法2:血清下手之后可以同时采取提高细胞密度的方法,从培养瓶换到六孔板,12 孔板等,细胞密度大,细胞分泌的细胞因子多,肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。——预防办法:细胞胞质疏松,老化的原因在于细胞
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问
引物合成引物有两个Tm值,如何确定PCR的退火温度?
zcldf001
以第一对引物为例:主要的问题是上游引物有稳定的loop,需要提高退火温度,引物只有打开二级结构后才能有效与模板结合。但是提高退火温度也会降低引物与模板结合的效率,这样就需要同时增加引物的量。摸索退火温度是要参考Tm,不确定各个公司引物合成单上的计算方法,你说的两种Tm是不同盐离子浓度条件下计算的:0.05M Na是指一般PCR体系中的盐离子浓度,因为大多数Taq PCR体系含50mM KCl。用o
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问
设计好的引物如何在NCBI 上比对?
goleo
引物比对在ncbi主页www.ncbi.nlm.nih.gov/上点blast,然后选择左上角那个版块里的search for short,nearly exact matches,输入上游引物序列,在下一行输入下游引物序列,选择你要看的种属(没有特殊要求就选择nr),点submit,在下一个窗口中点format,就可以了。这样是看一对引物的特异性。
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问
实时荧光定量试验,是否需要均一化处理?
剑藏鞘
内参的选择也很重要
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问
怎么 RT-PCR 老不出结果
zhangcs
我的目的基因长度是580bp,第一次三管p出来的也是580bp,污染或杂带也不会这么巧就出现在这个位置吧,另外我用的是同一台pcr仪,同试验室的师兄也用这台pcr仪,没问题呀,至于条件,我做过很多次梯度了,循环次数也改了很多次,由于我的目的基因比较长,4500bp,而且产物片断也比较长,我怀疑是不是目的基因断成小片断了,我因此也重提了很多次RNA,但还是不行呀,我下一步该怎么办,帮帮我吧,谢谢了!
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问
如何排除RT-PCR
life
结合个人实验,我觉得有两种方法可以佐证(1)如果你的正反向引物或只有一侧的引物可以设计在EXON的边缘,你可以在设计时,让一个引物的一部分跨过一个内含子,这样从DNA上是拉不到产物的,只有从CDNA上可以得到。(2)验证是否存在DNA污染,你也可以用其他已知基因的引物从DNA和CDNA拉出片段的差异来看你的模板中是否有DNA你可以结合验证,另外DNase消化时要充分
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问
关于 RT-PCR 的 RNA 提取
AIM9173
用飞捷的试剂盒试试,15分钟搞定,当然组织可能稍微费时一点。
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问
免疫组化中抗原修复的最佳条件是什么?尤其是微波修复。
丁香实验
关于抗原修复,我个人的观点和panther75有点不同。我试过的修复条件有EDTA热修复,柠檬酸钠为缓冲液的微波修复以及高压锅修复。从我的实验结果来看,微波修复其实很不容易掉片子的,而EDTA热修复和高压锅修复是很容易掉片子的。因为掉片子主要是因为加热过程中产生的气泡所引起,而微波修复水加热到沸腾,沾在片子上的气泡就会少,不会因为小气泡上串引起脱片。做EDTA修复时,你可以将片子靠的尽量近些,或是
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问
细胞转染后总是污染,求指教
波儿小芒
我建议你换个液看看,看镜头里面的图片,不太像是典型污染。如果液体不澄清,背景脏,那可能真的是污染。没事儿,你正常换液,主要操作的时候别与其他细胞一起操作。每次换液的时候,先用双抗原液清洗一下细胞。就算是细菌污染也不太要紧,一般通过抗生素洗涤和换液频率都能够挽救回来。当然了,如果你的细胞不是很珍贵,那你要评估一下有没有挽救的必要。
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