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        实时荧光定量试验,是否需要均一化处理?

        相关实验:实时荧光定量 PCR(realtime PCR)

        user-title

        dxy_feeoj3n6

        各位师兄师姐好,最近我在做实时荧光定量试验,做的是相对定量,关于往PCR管加样之前,各个处理组是否需要做均一化处理?是将各组提出的RNA进行稀释,均一化吗?还是将各组反转之后的cDNA,按照所提取的RNA浓度进行稀释,均一化呢?因为我们目前做出的结果,与我们预期的结果趋势相反,我担心是不是我的操作问题及计算方法的准确性导致的。
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        2 个回答

        user-title

        剑藏鞘

        有帮助
        内参的选择也很重要
        user-title

        Bio127

        有帮助
        RNA测浓度,以相同的投入量(比如50ng)进行反转录,反转录后的cDNA可以进行同等比例的稀释,这样测操作可以确保内参的扩增是齐的,最好在15-20CT之间。因为你做的是相对定量,所以其实即便前面没有归一化处理,也不影响后面相对定量的分析,因为前面RNA和cDNA含量的差异是你的目的基因和内参基因同等比例变化的,所以不会影响相对定量的趋势。相对定量不需要做标准曲线,但是你要是想测一下目的基因和内参基因引物的扩增效率就要做个模板的梯度(一般5个点),如果扩增效率一致在90%-110%那基本上没问题,这是2-ΔΔct统计分析的前提。最后统计方法2-Δct和2-ΔΔct的差异在于你有没有以对照组作为一进行归一化,对你对照组和实验组间的趋势是没有影响的。还有内参的选择确实是需要注意的,如做缺氧就不适合用GAPDH作为内参。(欢迎关注公众号:生物技术控,更多问题可留言)
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