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        如何排除RT-PCR

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        woodyqlee

        最近在试验中遇到一些问题,就是我在做RT-pcr的过程中,由于我引物设计只能设计在同一个外显子中,中间不能跨越内含子,所以我就不能从最后产物片断大小上来判断我的最后的产物到底是来源于cDNA还是RNA提取过程中的DNA污染。我看有的文章上说可以家DNase来消化DNA,但是我怎样才能知道DNA有没有彻底消化完全?有没有什么方法来证明,还希望各位大侠不吝赐教。
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        4 个回答

        user-title

        life

        有帮助
        结合个人实验,我觉得有两种方法可以佐证 (1)如果你的正反向引物或只有一侧的引物可以设计在EXON的边缘,你可以在设计时,让一个引物的一部分跨过一个内含子,这样从DNA上是拉不到产物的,只有从CDNA上可以得到。 (2)验证是否存在DNA污染,你也可以用其他已知基因的引物从DNA和CDNA拉出片段的差异来看你的模板中是否有DNA 你可以结合验证,另外DNase消化时要充分
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        chillow

        有帮助
        如果你的经费充裕的话,可以购买偶联有oligo-dt的层析柱,将提取的总rna过柱子,将mrna提纯出来,这样就可以了。很好用的!!!祝成功!!
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        zcjia

        有帮助
        要验证所提取的RNA中是否有DNA污染,根本不用重新设计引物或找其他的引物。 方法很简单,你可以直接用提取的RNA为模板来扩增,如果能扩增出条带,说明RNA中肯定有DNA污染;如果不能扩增出条带,那说明没有DNA污染。当然,前提是用你的引物和PCR反应体系能从你的反转录产物中(有无DNA污染都无所谓)扩增到大小正确的目的条带,也就是说必须保证你的引物和PCR反应体系是work的,而且扩出的条带不应该是由于污染造成的(即不加反转录产物的对照不能扩出条带)。 虽然RNA电泳也能大概判断有无DNA污染,但如果污染的DNA比较少的话,那RNA电泳就无能为力了。
        user-title

        life

        有帮助
        zcjia说的验证很直接,但有污染的话,还是需要处理,用其本身跨内含子的一侧或正反向引物可以不用考虑污染的问题,我们这么做效果比较好
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