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科研学霸天团,48小时有问必答
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提取的组蛋白Histone3怎么定量?
dxy_h7vcp8v3
首先检测内参的抗体和你自己目的蛋白是不一样的,从内参和目的蛋白WB来看,说明你自己的蛋白胶及转膜体系都没有问题。就应该在不同的地方找原因,其一检查目的蛋白的抗体是否过期或者长杂菌 ;其二,检查目的蛋白提取所用buffer是否调节至中性PH值,是否其中缓冲液让蛋白质变性导致没有条带 ;其三建议检查下,自己第一次提出来呢过程中的关键试剂,是否在后边提取中做了更换,检查更换的试剂是否正确。
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问
贴壁细胞蛋白提取相关问题
ZZDX-YILILI
1.首先你的这个方法从哪得到的我不是很清楚哈,根据我的经验,你这个4℃一小时时间相对就挺长的了,有可能会造成蛋白质降解。2.细胞系的话,一般冰上或者4℃裂解30分钟就足够了。3.裂解液的话,我一般用的是购买的RIPA,你这个tritonX裂解能力对细胞系应该太强了,尽量换下相对温和的裂解液。
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问
BCA测蛋白浓度相关问题
隔壁家的小夜猫子
确定你每个点都在标曲信任范围内么,另外稀释的时候取液太小不容易取准,建议梯度稀释。
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问
蛋白切割PH调节相关问题
一支肾上腺素
如果提高溶液的PH值,那么就要在溶液中加入大于这个PH的溶液;如果要降低溶液的PH值,那么可以加入小于这个溶液PH的溶液。在调节溶液PH的过程中,应该随时监测溶液PH的变化。
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问
sumo蛋白酶切不开带sumo标签的蛋白的原因?
dxy_d4xj2yg7
1. SUMO酶活性不佳,加对照蛋白验证酶活性有没有问题。2. 有可能是蛋白结构问题,标签的结构可能不正确,酶无法识别标签。可以考虑换个其他标签,比如EK,3C等。
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问
His tag蛋白镊柱纯化速度太慢是什么原因?
红格子一号
样本离心不彻底细胞碎片太多了导致堵了柱子
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问
纯化方法相关问题
一支肾上腺素
一定要记住56℃30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。如果温度过高,时间过久或摇晃不均匀都会导致沉淀物的增多。
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问
要送LC/MS液相色谱-质谱检测的co-IP胶条,操作全程注意事项?
一支肾上腺素
注意安全,有些试剂毒性很大,特别是后面处理,每一步都要小心注意。
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问
input control是什么意思?
医往情深丁香园
就是裂解的蛋白原液,如果目的蛋白表达量正常,这个是很容易曝光出来的。
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问
为什么有的蛋白可以测磷酸化有的测不了?
一支肾上腺素
磷酸化蛋白可能仅占细胞总蛋白中的一小部分,处理不得当时,还会快速的去磷酸化。磷酸化蛋白质 WB 做不好的原因有许多,比如封闭问题,抗体问题,或所需的磷酸化蛋白可能不存在于样品中或者低于 WB 检测的量。
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问
敷完二抗后可以隔夜曝光吗?有影响吗?
医往情深丁香园
可以隔夜曝光,一抗可以过夜敷隔日曝光都可以,二抗如果来不及当天曝光,不如就放在一抗里。
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问
WB转膜SIRT1蛋白一直失败的原因?
医往情深丁香园
说明你抗体有问题或者目的蛋白表达量有问题。如果他的也转不过去。
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问
目的蛋白和内参实测分子量都比预期大是什么原因?
一支肾上腺素
因为内参有好几种,分子量差别也比较大,更换分子量与检测蛋白差距更大的内参就可以避免这个问题。
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问
分泌性蛋白浓缩后做WB,如何选择内参?
我也是锦鲤ye
内参的选择需要考虑实际的试验环境。
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问
抗体相关问题
一支肾上腺素
一般来说,不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系,来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里, 如双标实验里,如果其中一个一抗是山羊来源的,一个是小鼠来源的,则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗,这时候,二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。
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问
条带出现斑点,内参却很整齐的原因?
红格子一号
封闭可能出了问题或者牛奶没混匀,建议用抗体稀释液
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问
测糖基化修饰水平出现两个条带的原因
医往情深丁香园
最好再重复一次实验看看,另外,别人做糖基化跑全膜,主要也是想说明多个糖基化的位点,所以可能出现条带的位置改变,在整张膜上,都可能出条带。
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问
有目的蛋白却没有actin和tublin的原因?
隔壁家的小夜猫子
gapdh这不是挺好的么,你那个基因可能影响贝塔actin表达了,用gap,不放心再用个别的内参试试。
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问
WB转膜中间marker颜色很浅的原因?
我也是锦鲤ye
很可能是转膜没转好,转过了;也可能是没配好。
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问
条带弯曲,中间高两边低的原因?
一支肾上腺素
可能的原因凝胶制备不均匀,中间冷却不好;或者是由于装置不合适,特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡,再一个就是可能凝固太快导致聚合不均匀。
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