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问
所有底物在孵育之前都要避光吗?
yfcwyh
ELISA实验中,在酶标抗体孵育,以及显色底物孵育这两步建议避光,其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹,或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。
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问
做COIP实验,互作的两个蛋白在目标位置有条带,但是阴性对照(NC)在相同蛋白分子量的位置也出现了浅条带,是什么原因?怎么改善?
小暮
阴性不应该有条带,有条带就是有结合,这个说明抗体有非特异结合的可能:1.抗体特异性不够,如果反复多次阴性对照出现条带考虑,更换抗体。2.上样错误,仅表现一次阴性对照阳性,重复实验就行
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问
免疫荧光中DAPI 信号过强甚至看不清细胞核轮廓和核仁是什么情况?
dxywode
1.组织切片太厚:这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。2.封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合,减少背景染色。如果背景太强,可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。
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问
请问流式细胞术染CD4 CD8 CD3的时候能否先固定,再染色?
dxywode
标本采集后要及时固定或深低温保存,以免组织发生自溶,DNA降解,而造成测试结果的误差。
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问
Western Blot转膜失败是为什么
小暮
(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜,缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液(pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离,从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变硬,从而抑制高分
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问
染色不清楚的原因是什么?
dxywode
应该是染液的问题哦,缓冲液的PH也有关系,最好在显微镜下边染色边观察。
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问
柱层析纯化抗体问题解答
府宅
色谱柱填装紧与否对分离效果很有影响,若松紧不均,特别是有断层时,影响流速zhi和色带的均匀,但如果装时过分敲击,色谱柱填装过紧,又使流速太慢。影响层析柱整体渗透速度分布不均,致使色素带不是整齐的环状色素带,进而增长分离各色素的时间,应在装填层析柱前用适量的丙酮润洗一下,后在装入氧化铝时应边加边敲打层析柱使氧化铝殷实,然后用真空抽滤方法,用乙醚进行抽滤至无气泡为止。
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问
重复性较差,做了两个复孔值相差太大,是什么原因?
dxywode
1、样品数量多少不一,加样时间有长有短;所以重复某一样品时,加样时间尽可能与第一次接近。2、保温时间不一致,洗涤条件不一致,操作人员不一致;重复测定标本,操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致,以排除这些因素造成的不一致的可能性。3、加样量不一致;样品稀释前应充分混匀,尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。
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问
花板实验终止后,整板结果呈现均一的黄色或淡黄色,或阴阳性对照、质控正常,阴性标本OD值过高。是什么原因?
dxywode
: ①整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成。②酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象。③孵育温度过高或孵育时间过长。④未按要求洗板,用自来水或其他公司洗液洗板,特别是洗液时每孔未注满洗液,易造成花板黄板现象。⑤阴阳性对照、质控正常,阴性标本OD 值过高的情况称为花板,一般是由于标本的收集、处理和保存方法不当,洗板不切底、显色时间延长造成。
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问
Elisa测定中出现了问题,可能会有哪些原因呢
dxywode
标准曲线较差、无信号、变异系数较大
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问
染色质为什么要片段化,片段化长度是多少
府宅
一般片段化的大小在200-1000bp,一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话,蛋白的结合位点很有可能被打断,原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp,加上不同核小体间的linker DNA序列,这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右,如果片段长度大于1000bp,您将会分离获得包含目标序列的DNA,但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有
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问
流式的电压如何调,怎么样是个标准
peaceful13
先用空白细胞,让细胞压在左下角的位置,然后可以用全染管样本,看一下所有检测通道电压是否在检测范围,最终上单染管确定最终电压值
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问
红斑狼疮的药物治疗?
府宅
如果仅有关节或者皮肤粘膜的这种受累比较轻的红斑狼疮,我们可以在密切监测病情,不选择激素,而选择非载体药、抗疟疾药,或者沙利度胺,这些药也能让病情得到有效的控制。
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问
用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白,两者操作过程有哪些不同?
小暮
原理都是一样的,就是固定方式不一样,细胞固定多用甲醛,组织切片固定多用多聚甲醛
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问
Elisa实验显示不明显问题
peaceful13
是所有孔显色都不明显?标曲如果也不显色,那应该是整个实验体系是有问题的,需要去深究一下原因,如果标曲显色是正常的,而样本显色比较低,一般就是样本含量的问题,如果确实是因为含量低的原因,那么需要优化一下样本的处理或者对样本蛋白进行提取过纯化
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问
在用流式分析TME中各种T淋巴细胞群的变化时,CD3这群细胞没办法从CD45中明显圈门出来,导致后面分析不够准确,请问有什么办法
Kimser
使用特异的单克隆抗体,进行多色分析,同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达
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问
流式实验的时候FCblocker 和FVD活性染料哪一个应该先放。
peaceful13
先染FVD死活,因为这个是染料会跟蛋白或者抗体结合,所以需要在无蛋白的缓冲液进行染色,Fcblocker主要成份刚好就是蛋白或者抗体,所以需要先染死活
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问
实验中,双向免疫扩散实验测得抗体效价为1:2,而ELISA实验测得得抗体效价却是1:32000,为什么差距?这么大?
府宅
在筛选抗体的时候,要看抗原表位位置,如果是线性表位,重组蛋白筛选没问题,如果非线性表位或者复杂结构包含着的,如果用重组蛋白表达出来,表位结构可能与真实结构不一致,从而导致筛选出来的抗体,并非真实表位相对的抗体,所以ELISA结果会有差距大
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问
石蜡切片染色要到什么程度呢?虽然是半定量的一个方法,太深太浅都对数据有影响。
桐轩456
我觉得这个程度只能是自己去分辨,每一步都必须准确操作,因为染色各步骤所需的时间,常受温度、切片厚度等影响,再说不同染色液染色后处理也不一样,所以一般只能根据镜下观察所见予以调整,然后再根据实验室的实际情况灵活掌握。
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问
我想设计一个实验研究的是姜黄素对小鼠作用,主要和一些介素有关,如小鼠介素2、IL-1B、IL-12、肿瘤坏死因子B。哪个最紧密?
peaceful13
你应该先搜索文献,这些因子主要跟哪些细胞相关,采取什么样的形式进行检测,需要有目标样本的确定性,再设计相关实验方法
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