实验问答

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科研学霸天团，48小时有问必答

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问放射免疫测定时，胰岛素释放试验的曲线特点？

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（1）胰岛素分泌不足型：为试验曲线呈低水平状态，表示胰岛功能衰竭或遭到严重破坏，说明胰岛素分泌绝对不足，见于胰岛素依赖型糖尿病，需终身胰岛素治疗。（2）胰岛素分泌增多型：患者空腹胰岛素水平正常或高于正常，刺激后曲线上升迟缓，高峰在2小时或3小时，多数在2小时达到高峰，其峰值明显高于正常值，提示胰岛素分泌相对不足，多见于非胰岛素依赖型肥胖者。该型患者经严格控制饮食、增加运动、减轻体重或服用降血糖药物

1 回答432 围观

问双向免疫扩散实验怎么判断抗原蛋白相对浓度？

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当两者在最适当比例处相遇时，即形成一条清晰的沉淀线。根据有否出现沉淀线，可用已知的抗体鉴定未知的抗原，或用已知的抗原鉴定未知的抗体。沉淀线靠近抗原孔，则提示抗体含量大；靠近抗体孔，则提示抗原含量较多；不出现沉淀线则表明抗体或抗原的缺乏或抗原过剩；另外，如出现多条沉淀线,则说明抗原和抗体皆不是单一的成分。因此，可用于鉴定抗原或抗体的纯度。

2 回答474 围观

问所有底物在孵育之前都要避光吗？

yfcwyh

ELISA实验中，在酶标抗体孵育，以及显色底物孵育这两步建议避光，其他步骤无需避光。避光可采用锡纸包裹，或将整个ELISA板子放入暗盒或抽屉等无光处即可。

1 回答398 围观

问做COIP实验，互作的两个蛋白在目标位置有条带，但是阴性对照（NC）在相同蛋白分子量的位置也出现了浅条带，是什么原因？怎么改善？

小暮

阴性不应该有条带，有条带就是有结合，这个说明抗体有非特异结合的可能：1.抗体特异性不够，如果反复多次阴性对照出现条带考虑，更换抗体。2.上样错误，仅表现一次阴性对照阳性，重复实验就行

3 回答471 围观

问免疫荧光中DAPI 信号过强甚至看不清细胞核轮廓和核仁是什么情况？

dxywode

1.组织切片太厚：这种情况下可以选择将组织切片变薄试试。2.封闭不佳:封闭的目的就是为了减少非特异性的结合，减少背景染色。如果背景太强，可以考虑换种封闭液或者增加封闭孵育的时间。

3 回答3738 围观

问请问流式细胞术染CD4 CD8 CD3的时候能否先固定，再染色？

dxywode

标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。

4 回答853 围观

问Western Blot转膜失败是为什么

小暮

(1) 膜没有完全均匀湿透使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000选择小孔径的膜，缩短转移时间。(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。(4) 甲醇浓度过高过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分

4 回答583 围观

问染色不清楚的原因是什么？

dxywode

应该是染液的问题哦，缓冲液的PH也有关系，最好在显微镜下边染色边观察。

3 回答465 围观

问重复性较差，做了两个复孔值相差太大，是什么原因？

dxywode

1、样品数量多少不一，加样时间有长有短；所以重复某一样品时，加样时间尽可能与第一次接近。2、保温时间不一致，洗涤条件不一致，操作人员不一致；重复测定标本，操作条件、人员等应尽可能与上次保持一致，以排除这些因素造成的不一致的可能性。3、加样量不一致；样品稀释前应充分混匀，尽可能使用同一移液器并装紧吸嘴。

3 回答386 围观

问花板实验终止后，整板结果呈现均一的黄色或淡黄色，或阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD值过高。是什么原因？

dxywode

: ①整板的黄板现象可能是由于错加其他试剂造成。②酶标对吸头的污染以及对盛放显色剂容器的污染都易造成黄板现象。③孵育温度过高或孵育时间过长。④未按要求洗板，用自来水或其他公司洗液洗板，特别是洗液时每孔未注满洗液，易造成花板黄板现象。⑤阴阳性对照、质控正常，阴性标本OD 值过高的情况称为花板，一般是由于标本的收集、处理和保存方法不当，洗板不切底、显色时间延长造成。

1 回答402 围观

问Elisa测定中出现了问题，可能会有哪些原因呢

dxywode

标准曲线较差、无信号、变异系数较大

3 回答613 围观

问染色质为什么要片段化，片段化长度是多少

府宅

一般片段化的大小在200-1000bp，一般300-600bp均能获得较好的ChIP结果。如果小于200bp的话，蛋白的结合位点很有可能被打断，原因是由于每个核小体结合DNA的序列长度为175bp，加上不同核小体间的linker DNA序列，这样每个核小体结合DNA的最小序列大概在200bp左右，如果片段长度大于1000bp，您将会分离获得包含目标序列的DNA，但所要研究的蛋白可能会离您目标序列有

2 回答793 围观

问石蜡切片在染色过程中总出现脱片现象的原因是？

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1.多聚赖氨酸玻片质量的问题。我原先是买的，后面补做第二批时用的病理科老师自己做的片子，要好一点。2.组织切的不好，切片机的问题例如比较老的旧的机器切得厚或者不均匀，或者切片者手法不好等。3.组织的问题，我用的组织癌症的很多，越是癌症组织有坏死之类越容易脱。4.没烤好，时间短温度不够之类。

3 回答1596 围观

问电泳液PH没问题，电极也没插反，为什么跑不出条带？

郭郭的郭郭

这个有许多原因，跑电泳有对照吗？比如marker.如果没有就是电泳问题，如果有，你看下有没有引物二聚体，如果没有，pcr整体肯定忘加东西了，需重做，如果有，就是你pcr体系本身有问题，需要优化，或是你的引物不好，需重新设计。还有就是琼脂糖里面忘记加溴化乙锭了，这个也有可能。

3 回答403 围观

问影响淋巴细胞转化的因素有哪些?

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⑴、受体细胞转化的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，它可容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。另外还应根据载体的性质及实验的目的选择合适的宿主。此外，受体细胞生长状态和密度也很重要。不要使用经过多次转接或储存于4℃的培养菌。细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，密度过高或不足均会影响转化率。⑵、载体DNA和重组DNA方面载体本身性质决定了转化的

3 回答783 围观

问对流免疫电流里，为什么抗原必须加在接电源阴极的孔呢？

郭郭的郭郭

跟在缓冲液中抗原抗体所带的电荷以及两者泳动的方向有关。在pH值8.6的琼脂凝胶中，抗体球蛋白只带有微弱的负电荷，而且它分子又较大，所以泳动慢，受电渗作用的影响也大，往往不能抵抗电渗作用，故在电泳时，反而向负极倒退。而一般抗原蛋白质常带较强的负电荷，分子又较小，所以泳动快，虽然由于电渗作用泳动速度减慢，但仍能向正极泳动。

3 回答488 围观

问用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？

小暮

原理都是一样的，就是固定方式不一样，细胞固定多用甲醛，组织切片固定多用多聚甲醛

2 回答675 围观

问Elisa实验显示不明显问题

peaceful13

是所有孔显色都不明显？标曲如果也不显色，那应该是整个实验体系是有问题的，需要去深究一下原因，如果标曲显色是正常的，而样本显色比较低，一般就是样本含量的问题，如果确实是因为含量低的原因，那么需要优化一下样本的处理或者对样本蛋白进行提取过纯化

4 回答362 围观

问实验中，双向免疫扩散实验测得抗体效价为1：2，而ELISA实验测得得抗体效价却是1：32000，为什么差距？这么大？

府宅

在筛选抗体的时候，要看抗原表位位置，如果是线性表位，重组蛋白筛选没问题，如果非线性表位或者复杂结构包含着的，如果用重组蛋白表达出来，表位结构可能与真实结构不一致，从而导致筛选出来的抗体，并非真实表位相对的抗体，所以ELISA结果会有差距大

2 回答602 围观

问用目标蛋白做IP，WB的时候孵Ub，但是目标条带位置没有ladder，该怎么改善条件？

dxywode

你可以加 NEM 抑制去泛素酶（DUB）的活性，或者干脆用 denaturing IP 去拉目的蛋白，然后检测泛素化。如果真的很难做，可以试试看过表达目的蛋白，再 IP ，当然无论如何也要用 NEM 或者 denaturing IP.

3 回答865 围观

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