Western Blot转膜失败是为什么

(1) 膜没有完全均匀湿透

使用 100% methanol 浸透膜。

(2) 靶蛋白分子量小于 10 000

选择小孔径的膜，缩短转移时间。

(3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值

可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液。

(4) 甲醇浓度过高

过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。

(5) 转移时间不够

对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

（1）抗体染色不充分

增加抗体浓度，延长孵育时间。

（2）酶活性降低

直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物。

（3）标本中靶蛋白含量太低

增加标本上样量。

（4）洗膜过度

缩短洗涤时间。

（5）HRP 抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

（6）抗体活性降低

选择在有效期内的抗体，工作液现配现用，避免长时间放置。

（7）封闭过度

减少封闭剂的量或缩短时间；换用不同封闭剂类型。

（8）曝光时间过短

延长曝光时间。

（9）HRP 抑制剂

所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠。

原因：1.甲醇浓度过高，过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离，从而沉淀在凝胶中，同时会使凝胶收缩或变硬，从而抑制高分子量蛋白的转移。降低甲醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替。2.转移时间不够，对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转移时间。

失败原因及解决策略（1) 膜没有完全均匀湿透，使用 100% methanol 浸透膜。(2) 靶蛋白分子量小于 10 000，选择小孔径的膜，缩短转移时间。（3) 靶蛋白等电点等于或接近转移缓冲液 pH 值，可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液（pH 10.5) 或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液